水中微生物能力驗證菌落總數的方法研究

陳曉瑜

(佛山市水業集團有限公司，廣東 佛山 528000)

水中微生物能力驗證菌落總數的方法研究

陳曉瑜

(佛山市水業集團有限公司，廣東 佛山 528000)

現時檢測水中菌落總數的方法有國家標準的平皿計數法和地方標準的復合酶底物法，通過能力驗證和實驗室間比對，科學分析少量數據并得出結果，兩種方法的結果均接近樣品真值，其中復合酶底物法呈現的結果更準確，不需要在無菌條件下操作，在實驗室經驗成本條件允許下可推廣該技術。使用平皿計數法比較兩種不同形態的菌種，結果得出當菌種體積越小、體液越深，在培養的時候越容易分辨個數，得出的結果越準確。

菌落總數；復合酶底物法；能力驗證；實驗室間比對

1 引 言

菌落總數作為判定水中被細菌污染程度的標志，長期作為常規指標觀察水體中細菌的性質和繁殖動態，對水質衛生標準提供科學依據。

在不同環境、不同操作人員、不同使用器皿的條件下，菌落總數的結果可能會受到影響，因此我們需要進行能力驗證，去查找在檢驗中是否存在問題，挖掘不足之處進行改進。國際間的微生物能力驗證十分成熟，有著十幾年的經驗成果；我國近年來引進了該系列能力驗證，包括菌落總數、總大腸菌群、糞大腸菌群、埃希氏菌群、甲第鞭毛蟲、隱孢子蟲等共6項微生物實驗室間能力驗證。以上能力驗證均被國際認可，通過驗證的實驗室及操作人員可獲頒證書；存在不足的實驗室，有專業的團隊協助發現問題，改進實驗室條件，以達到符合國家規定的實驗標準。

2 材料與方法

2.1 培養基和試劑

適用于《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》GB/T 5750.12-2006 1.1平皿法計數中的培養基，廣東環凱微生物科技有限公司生產的營養瓊脂培養基。

適用于《水中菌落總數符合酶底物檢測方法》DB44/T 1163-2013中的培養基套裝，包含SimPalte 100mL瓶裝無菌培養基和84孔穴樣品盤。

2.2 實驗儀器

恒溫生化培養箱、高壓滅菌鍋、便攜式紫外燈。

2.3 實驗方法及原理

2.3.1 樣品處理

將樣品凍存管從冰箱中取出，于室溫下平衡10至15分鐘。將100毫升無菌水倒入無菌取樣瓶中。打開樣品凍存管，將有顏色的圓形膠盤無菌操作轉移到裝有無菌水的取樣瓶中，充分振蕩后靜置10至15分鐘，直至圓形膠盤完全溶解，得到待檢測的樣品原液。

盲樣需再取90毫升無菌水倒入另一無菌取樣瓶，取10毫升樣品原液轉移到90毫升無菌水中，充分混合，得到待檢測的10倍稀釋度樣品。

從樣品接觸無菌水到完成檢測，全過程在45分鐘內完成。

2.3.2 平皿計數法

滅菌移液管吸取1毫升樣品，注入滅菌平皿中，傾注月15毫升已融化并冷卻到45℃左右的營養瓊脂培養基，并立即旋搖平皿，使樣品與培養基充分混勻。凝固后倒置放入36℃±1℃培養箱內，培養48小時。

質控樣品原液、盲樣樣品原液、盲樣10倍稀釋樣品等各做5個平行接種，合共3組樣品。同時對營養瓊脂和1毫升無菌水各做1個空白對照。

2.3.3 復合酶底物法

滅菌移液管吸取1毫升樣品和9毫升培養基加入到樣品盤中心，蓋上樣品盤蓋子，輕輕轉動樣品盤將液體分配到每個孔穴中。然后慢慢將盤子豎起90°至120°，將多余的液體吸到樣品盤中的還買上。把樣品盤緩慢倒置，放入36℃±1℃培養箱內，培養48小時。

已知盲樣樣品原液濃度在該方法上限值738MPN/mL范圍內，故只需使用原液做5個平行接種，合共1組樣品。用10毫升培養基做1個培養基空白，用1毫升無菌水代替樣品做1個純水空白對照。

3 結果討論

3.1 兩個方法菌落總數生長情況

每5個平行樣為一組的樣品，以樣品轉移到平皿或樣品盤的時間為排序方式，在45分鐘內完成整個操作過程，4組樣品中均沒有出現隨時間變化而有規律性的結果變化。具體結果如表1。

表1 平皿計數法、復合酶底物法菌落總數培養結果

在檢驗結果的可信度時，通過質控樣結果，可判斷在此次實驗操作過程中測量值的準確性是可信的。

在選取有效結果數值時，因每組樣品的樣品量較少，且微生物培養結果的允許限值跨度較大，通常在檢驗微生物結果時，取二倍相對偏差為合理范圍，對應此次實驗結果，各組樣品結果均在合理范圍之內，直接求得平均值得出最終結果。

在選擇平皿計數法中是否稀釋過的樣品作為最終結果時，按照GB/T 5750.12-2006 1.1.7的要求，“首先選擇平均菌落數在30～300之間者進行計算”，但是，根據實際情況，對平皿的觀察與比較，盲樣中的菌落形狀較小、輪廓清晰、分布均勻、數量可計數，同時考慮到通過二次稀釋，可能將外來菌種帶到樣品中造成結果偏高，故最終結果選取不經稀釋的培養皿進行計數與結果上報。

3.2 質控樣品與考核樣品菌種大小、形狀的對比

在相同的200倍顯微鏡放大后觀察質控樣和盲樣菌種大小及形狀，質控樣品最長直徑較大、整體呈橢圓形、兩頭較圓、菌種有透光性、濃度較高的時候培養效果容易結團連成一片；盲樣最長直徑是質控樣的25%、整體呈尖錐形、兩頭較尖、菌種透光度較低、濃度較高時候培養效果清晰可辨、不容易結塊結團。

4 小 結

微生物比對在國內處于起步階段，每年全國性的微生物實驗室間比對規模越來越大，認可度越來越廣，對實驗室能力要求也越來越高。

對于平皿計數法與復合酶底物法優越性比較，平皿計數法是傳統的檢測方法，低成本、應用時間長、技術成熟，對操作環境的衛生條件要求高，需要在無菌室內操作；復合酶底物法是近年開法出來的新方法，操作簡單，在普通的實驗室內也可以進行培養，多次質控樣的結果，復合酶底物法比平皿計數法更接近樣品真值，但實驗用的培養基培養皿等材料成本較高。

無論選取何種方法，若要做好實驗室間比對，前期準備工作至關重要。對恒溫培養箱48小時的恒溫觀察記錄、對實驗用具的清潔消毒、對培養基的儲存與配制，還有就是多次練習提升操作速度，從而能在規定的菌種活性有效時間內多做幾組平行樣。

[1]肖劍，李慧琴，陳楷，等.食品微生物能力驗證樣品菌落總數檢驗方法[J].食品安全質量檢測學報，2014，10(5)：3343-3348.

Study on Heterotrophic Plate Counts (HPC) Proficiency Test in Water Environment

CHEN Xiaoyu

(Foshan Water Group Ltd.，Guangdong Foshan 528000)

There are two methods to test HPC in water environment.One is traditional plate counts method，the other is SimPlate method. A proficiency testing with scientific data analysis，the testing result turned out that the SimPlate value is closer the true value than the traditional method.SimPlate method also can operate outside the aseptic environment. Moreover，two different colony samples were observed under microscope，a smaller shape and deeper color is easier to count.

Heterotrophic Plate Counts (HPC)；SimPlate；proficiency test；quality control

陳曉瑜，碩士研究生，從事水質檢測與分析工作

X21

A

1673-288X(2017)02-0104-02

引用文獻格式：陳曉瑜.水中微生物能力驗證菌落總數的方法研究[J].環境與可持續發展，2017，42(2)：104-105.