基于SSR標記的水稻光溫敏不育系遺傳多樣性分析

陳錦文，謝旺有，王天生，陳惠清，謝少和，黃榮裕，許桂芳

(福建省泉州市農業科學研究所，福建 晉江 362212)

基于SSR標記的水稻光溫敏不育系遺傳多樣性分析

陳錦文，謝旺有，王天生，陳惠清，謝少和，黃榮裕，許桂芳

(福建省泉州市農業科學研究所，福建 晉江 362212)

采用SSR分子標記對17個水稻光溫敏不育系進行遺傳多樣性分析。結果表明，在水稻基因組中較均勻分布的168個SSR位點中91個SSR位點具有多態性，多態性頻率為54.17%。91個SSR標記共檢測出229個等位基因，每個SSR位點檢測到2～4個，平均2.517個等位基因，平均多態性信息含量指數(PIC)為0.412。根據17份光溫敏不育系的遺傳相似系數矩陣作出樹狀圖，聚類分析結果表明17個不育系遺傳相似系數變幅為0.59～0.93；以遺傳相似系數0.61為閥值，可將供試不育系分為4個群，聚類分析結果與親緣系譜分析結果基本吻合。

光溫敏不育系；SSR標記；遺傳多樣性

水稻(OryzasativaL.)是世界上最重要的糧食作物之一，我國雜交水稻的推廣應用為糧食增產做出了巨大貢獻[1]。水稻作為自花授粉植物，雜交水稻的成功獲益于雄性不育的利用,包括細胞質雄性不育(Cytoplasmic male sterility, CMS)和核雄性不育(Genic male sterility, GMS)。石明松于1973年在湖北省沔陽縣發現了水稻變異株農墾58S[2-3]。作為天然光敏核不育水稻的新材料，農墾58S的發現開啟了我國在利用水稻雜種優勢培育兩系雜交水稻方面的新序幕[4]。1986年，袁隆平結合Ikehashi 等人報道的水稻廣親和研究成果，率先提出“兩系法”利用水稻雜種優勢的戰略設想，利用自然兩用系，即在長日高溫下制種，在短日低溫下繁種，一系兩用，從此拉開了大規模研究光溫敏核不育水稻的序幕[5]。此后，兩系法在培育雜交水稻新組合方面發揮了廣泛作用，據統計，截止2010年底，全國共有427個兩系組合通過審定，其中國審組合62個。目前兩系雜交水稻已經成為我國稻米生產中不可或缺的類型，在保障糧食安全中發揮著極其重要的作用[4]。

雜種優勢主要來源于雜交稻親本間的遺傳差異，親本間親緣關系越遠，雜種優勢越強。作為兩系雜交水稻的母本，光溫敏不育系對雜種優勢的貢獻很大，但由于光溫敏不育系的雄性不育性受遺傳與環境條件共同調控，因此篩選和培育優良的光溫敏不育系在生產上需要花費大量的人力、物力和財力。對水稻育種而言，遺傳多樣性越豐富，用于改良栽培品種或者選育新品種的潛力越大[6]。而優良育種材料的獲得在一定程度上取決于育種群體遺傳多樣性的豐富程度[7]。開展光溫敏不育系遺傳多樣性研究，有助于選配強優勢的兩系雜交稻組合，更有效地利用雜種優勢。

SSR分子標記由于具有靈敏度高、穩定性好、精確性和有效性高等優點，因此被廣泛應用于植物基因定位和QTLs分析、DNA指紋和品種鑒定、種質資源保存和利用、系譜分析和標記輔助育種等，目前也已成為遺傳多樣性分析應用最為廣泛的分子標記之一。伍豪等[8]利用34對SSR引物對廣西生產上主要應用的25份不育系進行遺傳多樣性分析，共檢測到112個等位基因，平均每對SSR引物可檢測到的等位基因為3.2941個，Nei’s基因多樣性指數平均為0.4922，平均多態信息含量(PIC)為0.4381，屬于中度多態位點，據此認為廣西生產上主要的不育系遺傳多樣性不高，親緣關系較近，遺傳背景較單一。馬旭丹等[9]利用56對SSR引物對20份水稻不育系進行遺傳多樣性分析，共檢測到191個多態性片段，平均3.41個等位基因，聚類分析結果與親緣系譜表現出較好的一致性。方珊茹等[10]利用99對SSR引物對15個不育系進行遺傳多樣性分析，結果共檢測到175個等位基因，平均2.47個，基因多樣性指數平均為0.716，PIC平均為0.393，聚類分析結果與供試的不育系譜相吻合。歐立軍[11]利用30對SSR引物對光溫敏不育系628S衍生的5個形態微變異的株系進行多態性分析，共獲得了4個多態性引物，多態性頻率13.33%，獲得了除11S之外4個株系特異性條帶，由此得到其它4個株系材料是新的遺傳變異的分子證據。郭慧等[12]利用135對SSR標記對24份水稻細胞質雄性不育系進行多態性分析，共獲得77個等位位點，平均多態信息含量(PIC)為0.254，分析表明生產上應用的細胞質雄性不育系遺傳背景比較單一，不利于充分發揮水稻的雜種優勢利用潛力。

本研究應用SSR分子標記對芽變103S衍生的農藝性狀差異較大的4個光溫敏不育系株系與生產上應用較多的13個光溫敏不育系進行了遺傳多樣性檢測，以期為此4個株系的差異比較、配組利用及生產上應用的光溫敏不育系的遺傳多樣性研究提供分子證據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取生產上廣泛應用的13個光溫敏不育系及本課題組選育的4個光溫敏不育系，共17份材料(表1)。

1.2 基因組DNA提取

2014年6月將17份材料種植于泉州市農科所洛陽基地，取在抽穗期經鏡檢敗育徹底的單株葉片，采用CTAB法提取基因組DNA，用BACK MAN DU 800分光光度計檢測DNA質量及濃度，將DNA濃度統一調整為50 ng/μL備用。

1.3 SSR分析

在水稻12條染色體上較均勻地選取168個SSR標記進行遺傳多樣性分析。選取的引物由上海生物工程有限公司合成。DNA片段擴增體系為10.0 μL，其中包括0.8 μL模板DNA (50 ng/μL)，1 μL 10×PCR buffer(Mg2+Plus)，0.4 μL dNTPs Mixture(各2.5 mmol/L)，SSR(10 μmol/μL)正、反向引物各0.25 μL ，0.2 μL Taq酶(5 U/μL)，6.5 μL ddH20 (PCR試劑購自Takara公司)，在型號為GeneAmp PCR System 9700儀器上進行擴增。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存備用。PCR產物在8%濃度的非變性聚丙烯酰胺凝膠上以90 V恒壓電泳120 min，用熒光染料Genefinder(購自廈門百維信生物科技有限公司)在搖床上染色20 min，最后在BIO-RAD凝膠成像系統上拍照保存，記錄電泳結果。

1.4 數據分析

一對SSR引物檢測單個位點，每個多態性條帶視為1個等位基因，參考網站http://www.gramene.org/中SSR標記信息記錄擴增片段的長度。根據引物擴增結果，選取擴增條帶清晰且具有多態性的SSR引物進行統計分析。根據擴增片段大小，建立1、0數據庫，在相同遷移位置上，有條帶的記為1，無條帶的記為0，缺失條帶的記為9。按照DNA分子標記數據分析方法[13]，將SSR標記作為等位基因進行多態性分析，每擴增得到的一條帶記為一個性狀。利用NTSYS 2.10數據分析軟件進行SHAN聚類分析，并繪制樹狀聚類圖。0～1數據采用DataTrans 1.0 程序轉化后[14]，應用Popgene 3.2計算等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Shannon’s信息指數(I)和平均多態性信息量指數(polymorphism information content，PIC)。

2 結果與分析

2.1 SSR標記的多態性

選用水稻12條染色體上均勻分布的168個SSR標記對供試光溫敏不育系進行多態性分析，共篩選出多態性標記91個，多態性頻率為54.17%。從表2中可看出，91個多態性標記共檢測到229個等位基因。不同標記所檢測到的等位基因數量不同，變異范圍為2～4個，平均為2.517個。其中RM6324、RM85、RM1359、RM473E、RM258、RM224和RM1261等7個標記的等位變異較為豐富，均能檢測到4個等位基因；其他大部分標記均能檢測到2～3個等位基因。Shannon’s信息指數I平均為0.671，變幅為0.224～1.320；平均多態性信息含量指數PIC為0.412，變幅為0.111～0.718；PIC值高于平均值的多態性位點數是52個，占57.14%；其中RM258的PIC最高，遺傳多樣性最豐富。圖1為RM366對供試不育系的多態性檢測結果。

2.2 聚類分析

基于91個多態性標記所獲得的數據，應用NTSYS軟件計算出供試光溫敏不育系間的遺傳距離為0.079～0.507，平均為0.376。根據遺傳距離采用UPGMA法進行聚類(圖2)，結果表明供試光溫敏不育系在閥值為0.59處聚為兩大類群，一類為培矮64S、Y58S、1892S、Y58-2S及未知系譜來源的潭S，彼此間的遺傳距離為0.157～0.454，平均為0.321，其中培矮64S、Y58S、1892S、Y58-2S均由農墾58S或其衍生系選育出來的，系譜來源未知的光溫敏不育系潭S聚在此群里。另一大類群包括本研究選用的其他光溫敏不育系。在閾值0.61處分為4個亞群，272S單獨分為一個亞群，與其它光溫敏不育系間的遺傳距離為0.341～0.476，平均為0.412，表現出較大的遺傳差異；株1S、陸18S、品57S、明軟02S及明糯S-1聚為一個亞群，彼此間的遺傳距離為0.205～0.393，平均為0.334；糯性光溫敏不育系明糯S-1單獨聚為一個亞群；廣占63-4S、RGD-7S及本課題組選育的4個光溫敏不育系聚為一個亞群。在閾值0.76處可將1202S與1211S、1215S及1217S區別，彼此間的遺傳距離為0.079～0.244，平均為0.173，這4個株系是由芽變103S選育出來的；同一系譜的株系1211S、1215S在閥值0.92處可以區別，遺傳距離為0.079。

1：Y58S；2：明軟02S；3：廣占63-4S；4：株1S；5：陸18S；6：272S；7：品57S；8：1202S；9：1211S；10：1215S；11：培矮64S；12：RGD-7S；13：1217S；14：Y58-2S；15：明糯S-1；16：1892S；17：潭S；M：DL100。

圖1 RM366對17個樣本的多態性分析

3 結論與討論

隨著分子標記技術的不斷發展，基于PCR技術的RAPD、AFLP、RFLP及SSR等分子標記被廣泛用于遺傳多樣性研究，前人[15-17]通過比較研究4種分子標記，認為SSR的多態性信息量最多。SSR是共顯性標記，因具有多態性豐富、操作簡單、檢驗快速、重復性好等優點，被廣泛應用于遺傳多樣性分析。

表2 91個SSR標記在供試不育系中的遺傳多樣性信息

本研究采用SSR標記將供試光溫敏不育系分為兩大類群4個亞群。272S單獨聚為一個亞群，它是以金山S-2為不育基因供體，用保持系金山1B為父本，通過金山S-2與金山1B雜交后再用金山1B回交1次，選育獲得的性狀優良的兩系不育系[18]，與同樣源于金山S-2的品57S間的遺傳距離為0.393，品57S與272S植株的農藝性狀差異較大，說明在雜交配組系譜篩選分離世代時，篩選得到了差異較大的兩個光溫敏不育系品種(系)。其它光溫敏不育系的遺傳差異較大。農墾58S及其衍生的光溫敏不育系聚為一個群，這與馬旭丹等[9]的研究結論一致，農墾58S類群通過聚類將未知系譜來源的潭S聚在農墾58S衍生選育的一個類群中，推測潭S為農墾58S或其衍生系選育而來。株1S、陸18S、品57S、明軟02S及明糯S-1聚為一個群，從系譜分析結果看，株1S與陸18S均是以抗羅早為母本選育而來[19]，具有相似的遺傳背景，彼此間的遺傳距離為0.203，聚類分析結果與系譜來源相吻合；來源于三明市農科院的光身糯稻光溫敏不育系明糯S-1是以SE21S為母本，雙光S為父本選育而來[20]，與明軟02S具有較近的遺傳背景，彼此間遺傳距離為0.389，明糯S-1的糯稻兼光身特性與其他幾個光溫敏不育系差異較大，在聚類中單獨聚為一個亞群。廣占63-4S、RGD-7S及本課題組選育的4個光溫敏不育系聚為一個群，廣占63-4S與RGD-7S的遺傳距離為0.419，廣占63-4S是N422S/廣占63經系統選育而成，RGD-7S是以測64S為母本、312/廣恢3550為父本選育成的RGD-7S與BL122雜交回交選育而成[19]，1202S、1211S、1215S及1217S均以芽變103S為母本選育而來，1217S是從黑米不育系1215S分離出來的株系，4個株系的聚類結果與系譜相吻合；聚類分析結果表明本課題組選育的4個光溫敏不育系與生產上大面積應用推廣的廣占63-4S及RGD-7S親緣關系更近。

圖2 17份光溫敏不育系的SSR聚類分析

傳統系譜分析法常缺乏育種家選種過程中產生的選擇和突變效應，所以僅僅用系譜法較難把握一些材料的親緣關系，而分子標記技術可以準確檢測到材料中DNA水平上的遺傳變異，能夠更好地為材料利用提供指導[21]。田間農藝性狀觀察、系譜分析及分子標記技術相結合應用，可對現行資源的充分開發利用及其對新的種質資源的綜合利用提供良好的指導。利用SSR分子標記對水稻光溫敏不育系進行多樣性研究，可為兩系雜交稻的遺傳改良和親本配組提供理論依據，對提高分子育種水平及光溫敏不育系的挖掘利用有著積極的推動作用。筆者利用上述基于分子標記鑒定存在差異位點的4個光溫敏不育系，正加緊進一步進行雜交配組，以期選育出新的強優勢兩系雜交稻新組合。

[1] 程式華,李建.現代中國水稻[M].北京：金盾出版社,2007.

[2] 石明松.晚粳自然兩用系選育及應用初報[J].湖北農業科學,1981(7):3.

[3] 石明松.對光照長度敏感的隱性雄性不育水稻的發現與初步研究[J].中國農業科學,1985(2):44-48.

[4] 斯華敏,劉文真,付亞萍,等.我國兩系雜交水稻發展的現狀和建議[J].中國水稻科學,2011,25(5):544-552.

[5] 袁隆平.雜交水稻超高產育種戰略設想[J].雜交水稻,1986(2):3-4.

[6] 趙一洲,李正茂,路洪彪,等.遼寧省水稻骨干親本演變及遺傳多樣性分析[J].河南農業科學,2014,43(12):28-33.

[7] 張繼峰,劉玉梅,方智遠,等.青花菜相同親本的DH與F2群體遺傳多樣性的比較[J].園藝學報,2012,39(6):1090-1098.

[8] 伍豪,劉百龍,王威豪,等.廣西生產上主要應用的三系雜交稻不育系遺傳多樣性分析[J].南方農業學報,2015，45(4):550-554.

[9] 馬旭丹,孫遼,李元元,等.部分水稻不育系的指紋圖譜構建和遺傳多樣性分析[J].雜交水稻, 2015(6):64-70.

[10] 方珊茹,鄭燕梅,吳春珠,等.基于SSR標記的雜交秈稻主要不育系遺傳多樣性分析[J].福建農業學報,2012,27(11):1173-1177.

[11] 歐立軍.微衛星(SSR)分子標記在雜交水稻不育系不同株系遺傳差異分析中的應用[J].江蘇農業科學,2009，37(5):45-46.

[12] 郭慧,李樹杏,徐建第,等.24份水稻細胞質雄性不育系的SSR多態性分析[J].雜交水稻,2007,22(3):56-61.

[13] 周延清.DNA分子標記技術在植物研究中的應用[M].北京:化學工業出版社,2005:249-252.

[14] 蓋紅梅,任民.SSR數據處理宏程序DataTrans 1.0[J].分子植物育種:網絡版,2011(9):1359-1365.

[15] Pejic I, Ajmone-Marsan P, Morgante M, et al. Comparative analysis of genetic similarity among maize inbred lines detected by RFLPs, RAPDs, SSRs, and AFLPs[J]. Theoretical and Applied Genetics, 1998, 97: 1248-1255.

[16] 袁力行,傅駿驊,Warburton M, et al.利用RFLP、SSR、AFLP和RAPD標記分析玉米自交系遺傳多樣性的比較研究[J].遺傳學報,2000,27(8):725-733.

[17] Belaj A, Satovic Z, Cipriani G, et al. Comparative study of the discriminating capacity of RAPD,AFLP and SSR markers and of their effectiveness in establishing genetic relationships in olive[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2003, 107(4): 736-744.

[18] 吳建梅,林荔輝,林培清,等.優質水稻光溫敏核不育系272S的選育[J].雜交水稻,2012,27(1):11-15.

[19] 斯華敏,付亞萍,劉文真,等.水稻光溫敏雄性核不育系的系譜分析[J].作物學報,2012,38(3):394-407.

[20] 黃顯波,鄧則秦,鄭家團,等.光身糯稻兩系不育系明糯S-1選育研究[J].福建稻麥科技,2006,24(1):1-2.

[21] 王勝軍,陸作楣,萬建民.采用表型和分子標記聚類研究雜交秈稻親本的遺傳多樣性[J].中國水稻科學,2006,20(5):475-480.

(責任編輯：許晶晶)

Genetic Diversity Analysis of Rice PTGMS Lines Based on SSR Markers

CHEN Jin-wen, XIE Wang-you, WANG Tian-sheng, CHEN Hui-qing,XIE Shao-he, HUANG Rong-yu, XU Gui-fang

(Quanzhou Institute of Agricultural Sciences in Fujian Province, Jinjiang 362212, China)

The genetic diversities of 17 rice PTGMS lines were analyzed by adopting 168 pairs of SSR markers which were evenly distributed on the 12 chromosomes of rice. Among these 168 pairs of SSR markers, 91 pairs of SSR markers showed a polymorphism with the polymorphic frequency of 54.17%. A total of 229 alleles were detected with these 91 polymorphic SSR markers, and the number of alleles per SSR locus ranged from 2 to 4 with an average of 2.517. The average polymorphic information content index was 0.412. According to the genetic similarity coefficient matrix of the tested 17 rice PTGMS lines, a dendrogram was constructed by UPMGA, and a clustering analysis was conducted, the results showed that the range of genetic similarity coefficient of 17 rice PTGMS lines was 0.59～0.93. When genetic similarity coefficient 0.61 was used as a threshold, the tested rice PTGMS lines could be divided into four groups, which was basically consistent with their pedigree relationship.

PTGMS line; SSR marker; Genetic diversity

2016-11-14

泉州市優秀人才培養專項(14A27)；福建省泉州市科技項目(2014N29、2015N27)；福建省星火項目(2016S0015)。

陳錦文(1984─)，男，福建德化人，助理研究員，碩士研究生，主要從事水稻抗病育種研究。

S511

A

1001-8581(2017)03-0001-06