基于溶藻效果的溶藻細菌A21培養基成分優化

李文利++傅以鋼++劉征宇++章忠輝++陸雅雅

摘要：藍藻“水華”的暴發對人體健康、水產養殖等造成了嚴重影響，微生物法是一種安全、有效的水華防治方法。通過碳源及氮源的單因素試驗、Plackett-Burman試驗設計、響應面試驗分析對A21菌株的培養基進行優化，最佳培養基配方為蔗糖6.5 g/L、酵母膏13 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO4 0.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.15 g/L、MnSO4 0.5 g/L、pH值8.2。該培養基使A21菌株對銅綠微囊藻的葉綠素a（葉綠素a）清除效率提高了5.18%。

關鍵詞：藍藻；溶藻細菌；培養基；優化；Plackett-Burman試驗；響應面分析

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0516-05

收稿日期：2015-04-08

基金項目：國家自然科學基金（編號：21277101）；上海海洋大學橫向課題（編號：D-8006-13-0117）。

作者簡介：李文利（1988—），女，江蘇徐州人，碩士，主要從事食品微生物研究。E-mail：1067349333@qq.com。

通信作者：李曉暉，博士，副教授，主要從事食品生物技術研究。E-mail：xhli@shou.edu.cn。

人為因素導致太湖水體富營養化進程加速，于2007年暴發了大規模“水華”，給當地居民帶來了恐慌[1]。近年來的監測結果顯示，60%太湖水域的營養化水平處于中度污染以上，東萊水系等甚至達到重度污染，其余水域均為輕度污染[2-4]。微囊藻是太湖藍藻“水華”的優勢藻類，銅綠微囊藻（Microcstis aeruginosa）是其代表藻株，其細胞內含有多種色素蛋白，生長速度極快，并產生對人體有害的微囊藻毒素[5-6]。水體富營養化水平持續偏高帶來的“水華”現象令人堪憂，尋求一種高效、環保的抑藻物質迫在眉睫。

從“水華”暴發水體中分離安全、有效的溶藻細菌是一種有效的防治手段和途徑，為水污染治理提供了新的研究思路[7-9]。現已報道多株分離自太湖水域的溶藻細菌，為抑制藍藻“水華”現象提供了良好基礎，但大多處于分離鑒定階段，對于抑藻物質制備成本高、生物活性低且不穩定、二次污染等生物安全性問題尚有待進一步研究，以期實現溶藻微生物在治理“水華”中的應用[10]。

本研究通過優化溶藻菌株A21的培養基成分，提高對M. aeruginosa 905生物量的清除率。在單因素試驗的基礎上進行Plackett-Burman（PB）設計，選擇出溶藻菌株A21溶藻效果的主要影響成分；根據PB試驗結果進行響應面試驗設計（response surface methodology，RSM），建立預估模型，得到估算的最佳培養基配方；根據實際情況進行調整，得到溶藻菌株A21的最佳培養基配方。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藻種和菌種

銅綠微囊藻905（M. aeruginosa 905）購自中國科學院水生生物種質庫淡水藻種庫，轉接至新鮮的BG11培養基中，于25 ℃、光照度2 000 lx、光—暗周期14 h—10 h條件下培養[11]。溶藻菌株A21由筆者所在實驗室利用原位取樣法[12]從太湖暴發藍藻“水華”的水域分離得到，經鑒定為芽孢桿菌屬。

1.1.2主要試劑

溶藻菌株A21的基礎培養基成分為碳源5 g/L、氮源10 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO4 0.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.15 g/L、MnSO4 0.5 g/L，采用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH將pH值調至70。營養瓊脂和營養肉湯用于A21菌株的活化和培養；魯格氏碘液用于藻細胞固定；丙酮用于銅綠微囊藻細胞葉綠素的提取。

1.1.3主要儀器

SPX-250PG型智能型光照培養箱（上海天恒醫療機械有限公司），SQ-UV2300型紫外可見分光光度計（北京宇艾奇電子科技有限公司），CX21型光學顯微鏡（OLYMPUS 奧林巴斯），藻類計數框（新科儀器，計數區 20 mm×20 mm，100個小格），TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機（湘潭湘儀儀器有限公司）等。

1.2方法

1.2.1溶藻試驗

A21菌株經營養瓊脂活化后接種在新鮮的基礎培養基中，于37 ℃、180 r/min條件下培養12 h。將菌液以4 000 r/min離心10 min，取0.5 mL上清液與4.5 mL生長對數期的M. aeruginosa 905藻液進行混合，同時取0.5 mL滅菌的基礎培養液與4.5 mL生長對數期的M. aeruginosa 905藻液混合作為對照組，置于25 ℃、光照度2 000 lx、光—暗周期14 h—10 h條件下培養5 d。

1.2.2碳源和氮源的單因素選擇

根據微生物營養代謝方式的不同，選擇可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、乙酸鈉等為碳源，選擇硝酸鉀、硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素為氮源。采用不同的碳源、氮源分別培養菌株A21后進行溶藻試驗。

1.2.3Plackett-Burman設計變量

采用Mintab 16軟件進行Plackett-Burman（PB）設計，對影響A21菌株生長的9個培養基成分進行考察，即碳源、氮源、NaCl、K3PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4、培養基初始pH值。每個因素取高水平和低水平2個水平，高水平為低水平的1.5倍。另設X4、X8、X12為虛擬列，在試驗中為空，以考察試驗誤差。以葉綠素a清除率（%）為響應值，設定3個平行試驗，試驗設計見表1。

1.2.4響應面試驗設計在Plackett-Burman試驗的基礎上確定響應面分析的因素與水平，采用Box-Behnken中心組合設計4因素3水平共29個試驗點進行試驗。優化A21菌株的培養基成分，并在最佳培養基成分配比下對銅綠微囊藻葉綠素a清除率進行3次平行試驗，證實響應面分析法的可靠性。

1.2.5M. aeruginosa 905生物量指標葉綠素a濃度的測定在超聲條件下使M. aeruginosa 905藻細胞破碎并釋放出葉綠素a，利用丙酮于低溫黑暗條件下萃取12 h后離心，分別于630、647、664、750 nm下測定上清液的吸光度[11-13]。根據公式（1）計算葉綠素a含量：

C（mg/L）=11.85（D664 nm- D750 nm）-1.54（D647 nm- D750 nm）-008（D630 nm- D750 nm）。[JY]（1）

式中，D664 nm、D647 nm、D630 nm、D750 nm分別表示波長為664、647、630、750 nm 時提取液的吸光度。

根據公式（2）計算A21菌株的葉綠素a清除率（A）：

[JZ（]A=（1-Dt/Dc）×100%。[JZ）][JY]（2）

式中，Dt（mg/L）、Dc（mg/L）分別為試驗組、對照組的葉綠素a濃度。

1.2.6數據處理利用Mintab 16、Design-expert 8.0、Excel 2010軟件對試驗數據進行分析處理。

2結果與分析

2.1碳源及氮源的選擇結果

將A21菌株接種于營養肉湯中，于37 ℃下培養12 h，離心去除菌體后與銅綠微囊藻液混合，5 d后溶藻試驗結果見圖1。可見其溶藻能力較好，經計算得到葉綠素a清除率為80.34%。

[FK（W10][TPLWL1.tif]

以蛋白胨為氮源選擇不同碳源，其他成分與基礎培養基一致，試驗結果見圖2。以蔗糖為碳源選擇不同氮源，其他成分與基礎培養基一致，試驗結果見圖3。以蔗糖為碳源時，A21菌株對葉綠素a的清除率最高，為79.21%；以酵母膏為氮源時，A21菌株對葉綠素a的清除率最高，為81.27%。

2.2Plackett-Burman試驗設計結果

利用Mintab 16軟件進行Plackett-Burman設計，對影響

[TPLWL2.tif]

A21菌株生長的9個培養基成分進行考察，即蔗糖、酵母膏、NaCl、K3PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4、培養基初始pH值。在單因素試驗的基礎上，采用Plackett-Burman設計創建試驗次數n=20的試驗，對12個因素（9個實際因素、3個虛擬因素）進行考察。每個因素取高水平和低水平2個水平，以葉綠素a清除率（%）為響應值，試驗設計及試驗結果見表2。利用Mintab 16軟件對試驗結果進行分析（表3、圖4），可見培養基中蔗糖、酵母膏、磷酸鉀、初始pH

[TPLWL3.tif]

值對菌株A21的溶藻效果影響顯著（P<0.05）。R2為9433%，R2（預測）為95.34%，表明該結果的可信度較高。

2.3響應面試驗設計與結果

在PB試驗設計的基礎上確定4個主要影響因素，根據Box-Behnken中心組合設計原理，利用Design-Export 8.0軟件對蔗糖、酵母膏、磷酸鉀、初始pH值進行4因素3水平的響應面分析試驗，試驗設計與結果見表4、表5。

該響應面試驗設置4個中心點，共有29個處理，重復3次以評估試驗誤差。采用Design-Export 8.0數據處理軟件

對表6中的數據進行二次多元回歸擬合，以葉綠素a清除率（Y，%）為因變量，以蔗糖（X1，g）、酵母膏（X2，g）、磷酸鉀（X3，g）、[JP2]初始pH值（X4）為自變量建立回歸方程。根據表6中各因素的P值去除回歸方程中影響不顯著的因子，對二次回歸方程進行優化得到回歸方程：Y=80.485 2+0.572 5X1+2.096 7X2-2.245X3+0.412 5X4+1.22X1X2-1.302 5X1X3+2.47X2X3+1.315X2X4-1.667 5X3X4-5.839 75X12-2753 5X22。

由表6、表7可知，A21菌株培養基成分優化回歸模型的P值<0.000 1，失擬的P值為0.508 1，表明回歸模型高度顯著（P<0.05），失擬檢驗不顯著（P>0.05）。桑葉黃A21菌株培養基成分優化回歸模型的校正確定系數R2為0.948 6，表明模型能解釋約94.86%響應值的變化，僅有5.14%的總變異不能用該模型解釋。確定系數R2為0.974 3，表明模型擬合程度良好、試驗誤差小，該回歸模型可用來分析和預測A21菌株培養基成分優化的情況。

響應面3D圖和等高線（圖5）可直觀反映各因素間的交互作用及其強弱[14-15]。

2.4最佳培養基配方與驗證試驗

采用Design-Expert V8.0.6軟件預測A21菌株的最佳培養基配方為蔗糖6.475 g/L、酵母膏13.025 g/L、磷酸鉀 0.5 g/L、pH值8.2，此時A21菌株培養液的葉綠素a清除效率為85153 4%。根據實際情況進行調整，最佳試驗配方為蔗糖6.5 g/L、酵母膏13 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO4 0.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2 0.15 g/L、MnSO4 0.5 g/L、pH值8.2。進行多次驗證試驗，菌株A21培養液的葉綠素a清除效率為84.5%，相對誤差為07%。通過對培養基成分的優化，菌株A21的葉綠素a清除效率提高了518%。

3結論

菌株A21是一株高效、安全的溶藻細菌，細菌中的某些代謝產物可促使藻細胞死亡。為進一步提高菌株A21的溶藻能力，通過碳源和氮源的單因素選擇試驗、PB試驗設計、響應面試驗設計對菌株A21的培養基成分和配比進行研究，得到該菌株的最佳培養基配方，其葉綠素a清除效率由8034%提高至84.50%。[CM（21*2/3]本研究結果為菌株A21及其發酵產物在藍藻“水華”治理中的應用提供依據。

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