HPLC—MS/MS法測定鴨肉中氯霉素類藥物殘留

陳曉蘭 陳未 王帥兵 蔣春茂

摘要：現有動物性食品中氯霉素類藥物殘留檢測前處理方法較為復雜，為簡化樣品分析方法，建立簡單的樣品前處理方法和HPLC-MS/MS方法，以同時檢測鴨肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考殘留。以50%乙腈制備組織勻漿液，向勻漿液中添加對照藥物后采用乙腈去蛋白，高速離心，選擇0.1%乙酸和乙腈-甲醇（1 ∶[KG-*3]1）為流動相，以 0.5 mL/min 流速梯度洗脫，LC-MS/MS電噴霧電源（ESI），負離子，選擇多反應監測（MRM）模式檢測，并對所建立的方法進行方法學驗證。在所建立的樣品前處理和色譜條件下，3種目標化合物在3 min內實現同時分離，標準工作曲線在 0.025～5.000 μg/g范圍內線性良好，r2為0.995 8～0.997 6。最低檢測限均為2.5 ng/g，最低定量限為 25 ng/g。在添加量為20、50、100 ng/g的水平下，平均回收率為93.26%～97.25%，RSD為0.47%～1.83%。本試驗采用較為簡單的乙腈蛋白沉淀法，操作簡易，過程提取回收率高，可大幅提高樣品前處理的效率，在所建立的色譜條件下檢測靈敏度大幅提高。該方法簡易可行，能滿足國際氯霉素類藥物殘留檢測的要求。

關鍵詞：HPLC-MS/MS；氯霉素；甲砜霉素；氟苯尼考；鴨肉；殘留

中圖分類號： TS207.5文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0316-04

[HJ1.3mm]

收稿日期：2015-11-16

基金項目：江蘇省泰州市社會發展項目（編號：TS032）。

作者簡介：陳曉蘭（1979—），女，江蘇海安人，博士，講師，主要從事新藥研究。E-mail：cxl7972563@163.com。

通信作者：蔣春茂，博士，教授，主要從事新獸藥研究。E-mail：cmj109@126.com。

動物源食品（肉、蛋、奶、水產及其制品）的安全是全世界關注的焦點，其中獸藥殘留問題是影響動物源食品安全的重要因素之一[1]。氯霉素類藥物屬于廣譜抗生素，對革蘭氏陰性及陽性細菌均有抑制作用，主要包括氯霉素（chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素（thiamphenicol，TAP）、氟苯尼考（florfenicol，FF）等。氯霉素可抑制人類骨髓的造血功能，引起再生障礙性貧血，在美國、歐盟及我國均被禁用于食品動物，同時規定了禽肉中甲砜霉素、氟苯尼考的最高殘留限量分別為50、100 ng/g。目前，氯霉素類藥物殘留的檢測方法主要有微生物法[2]、酶聯免疫法[3]、共振生物傳感器法[4]、氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]、超高效液相色譜法[7]、氣相色譜-質譜法[8]、液相色譜-質譜法[9]、超高效液相色譜-串聯質譜法[10-12]等。

目前，動物性食品中氯霉素類及其代謝物的殘留檢測前處理方法較為傳統，藥物與雜質間分離度差，且復雜的前處理程序影響了樣品回收率。如何簡化前處理方法是目前該類藥物檢測中亟待解決的關鍵問題。僅采用HPLC技術或GC技術已無法滿足多殘留檢測的要求，且其在鴨肉殘留檢測方法中的應用尚未見國內外報道。鑒于此，本研究擬將快速溶劑萃取（ASE）技術應用于樣品前處理，采用HPLC-MS/MS法建立快速、簡易、高靈敏、高通量的禽肉中氯霉素類及其代謝物的多殘留快速檢測技術，為獸藥殘留監控體系的建立和完善提供先進的技術資料，對于我國動物性食品出口貿易更好地與國際接軌、保障人類健康具有重要意義。

1材料與方法

1.1藥物與試劑

氯霉素對照品購自中國食品藥品檢定研究所，批號為130555-201203。甲砜霉素對照品購自中國獸醫藥品監察所，批號為k0240706。氟苯尼考對照品購自中國獸醫藥品[JP2]監察所，批號為k0301305。7-羥基雙香豆素標準品購自Sigma-Aldrich公司，批號為STBD2336V。氯霉素原料藥購自鄭州津北化工有限公司。甲砜霉素粉（5%）、氟苯尼考粉（10%）均購自江蘇中牧倍康藥業有限公司。乙腈為色譜純，購自Fisher scientific公司。二甲基亞砜（DMSO）為色譜純，購自國藥集團化學試劑有限公司。乙酸為色譜純，購自Sigma-Aldrich公司。

1.2儀器與設備

API4000 Q-trap型三重四級桿/離子阱質譜儀，包含電噴霧電離源（ESI源）（美國應用生物系統公司）；1200系列高效液相色譜系統（美國安捷倫科技有限公司）；CTC PAL型自動進樣器（CTC Analytics，AG，瑞士）；FA25型高速勻漿機（Fluko公司）。

1.3試驗動物及處理

雛鴨購自江蘇省海安縣某孵化場，選擇無抗飼料飼養至30日齡。將鴨分為2組，其中一組給以氯霉素原料藥、甲砜霉素粉、氟苯尼考粉，均按說明書劑量拌料給藥，連用3 d；另一組為對照組，不給以任何藥物。分別在給藥后3 d將其剖殺，取各組肌肉，于-20 ℃保存備用。

1.4試驗方法

1.4.1系列標準工作溶液的配制

精確稱取適量氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考標準品，分別置于20 mL容量瓶中，采用DMSO溶解并定容，超聲促溶，充分搖勻，配制成1 mg/mL的標準儲備液。采用移液槍各取100 μL標準儲備液于700 μL乙腈中，配制成100 μg/mL的混合工作液。采用乙腈梯度稀釋至5.000、2.000、1.000、0.500、0.200、0.100、0.050、0.025 μg/mL 的混合系列標準工作溶液。

1.4.2內標工作溶液的配制

精確稱取適量7-羥基雙香豆素標準品，置于10 mL容量瓶中，采用DMSO溶解并定容，超聲促溶，充分搖勻，配制成2 mg/mL的標準儲備液。采用乙腈稀釋至200 ng/mL，儲存備用。

1.4.3空白肌肉勻漿液

稱取一定量的鴨空白肌肉樣品，剪碎，加入10倍體積的50%乙腈，將樣品置于冰浴，采用高速勻漿機進行勻漿處理，得到均一的勻漿液。

1.4.4標準工作曲線的前處理

取5 μL系列標準工作液（5.000、2.000、1.000、0.500、0.200、0.100、0.050、0.025 μg/mL）加入至50 μL空白肌肉勻漿液中，渦旋振蕩 30 s，加入150 μL內標工作溶液，渦旋振蕩3 min，使蛋白充分沉淀；于4 ℃、14 000 r/min條件下離心10 min，取150 μL上清液加入至150 μL超純水中，混合均勻后待進樣。標準曲線的系列濃度為2.50、5.00、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0 ng/mL；肌肉勻漿為10倍體積勻漿液，因此在肌肉中的定量范圍為25.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0、2 000.0、5 000.0 ng/g。

1.4.5給藥鴨肌肉樣品前處理

取給藥鴨肌肉勻漿液 50 μL，加入5 μL乙腈，使其與空白添加樣品（標準曲線）的基質保持一致；加入150 μL含內標的乙腈，渦旋振蕩3 min，于4 ℃、14 000 r/min條件下離心10 min，取150 μL上清液加至150 μL超純水中，混合均勻后待進樣。

1.4.6HPLC色譜條件

采用CAPCELLPAK型色譜柱（MG，50 mm×2.0 mm，I.D. 5 μm）（日本資生堂），流動相A為01%乙酸，流動相B為乙腈-甲醇（體積比1 ∶[KG-*3]1），進樣體積為 10 μL，梯度洗脫條件見表1。

質譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），應用負離子模式，檢測方式為多反應監測（MRM）。質譜離子源參數分別為CUR 40.00、CAD-2.00、IS-4 500.00、TEM 400.00、GS1 40.00、GS2 50.00、ihe ON。化合物質譜參數見表2。采用Analyst 1.4.2質譜采集與分析軟件。

1.4.7加標回收率

在空白鴨肉中，分別添加25、50、100 g/kg 質量濃度水平的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考對照品，每個質量濃度水平設3個平行試驗，計算3種物質的加標回收率和相對標準偏差（RSD）。

2結果與分析

2.1質譜條件的優化

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的平均分子量分別為 323.13、356.22、358.20，這3個化合物均含有2個Cl-離子。Cl在自然界中有2種同位素，即35Cl、37Cl，其分子量分別為34.969、36.966，豐度分別為75.77%、24.23%。為獲得更高的靈敏度，以含35Cl的化合物作為目標化合物進行檢測，經計算，含35Cl的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的準確分子量分別為322、355、357。

預先配制50、100、150 ng/mL質量濃度的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考標準溶液，以流動注射的方式在負離子模式下進行一級質譜母離子全掃描，分子離子m/z分別為320.9、353.9、355.9，其中50 ng/mL分子離子的響應在106 cps附近，即為最佳優化質量濃度。以50 ng/mL質量濃度在負離子模式下進行自動優化，以確定最高響應二級離子m/z以及相應的DP、CE、CXP參數（表2）。最終優化ESI源的碰撞電壓、離子化溫度、氣簾氣等參數。

2.2色譜條件的優化

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考均為弱極性化合物，極易溶解于甲醇、乙腈。本研究以含0.1%乙酸作為水相，0.1%乙酸能促進分子的電離，大幅增強檢測信號的強度；以等比例甲醇-乙腈作為有機相，隨著有機相比例的提高，目標物保留時間縮短，但分離效果較差，如果有機相比例過低，其色譜峰較寬，靈敏度將隨之降低。等度洗脫要將3個目標化合物同時分離，單個樣品的檢測時間較長，因此最終選擇梯度洗脫，可在較短時間內將3個化合物很好地分離，同時提高了分析效率及檢測靈敏度。

2.3樣品的提取

在動物組織樣品中，氯霉素類藥物的常用提取溶劑為乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯等。本試驗采用較為簡單的乙腈蛋白沉淀法，過程提取回收率約為95%，符合要求且步驟簡單，可大幅提高樣品前處理的效率。

2.4方法的線性范圍、定量限和檢測限

標準工作曲線的處理見“1.4.4”節，進樣10 μL。在本方法所確定的試驗條件下，采用Analyst 1.4.2軟件進行數據的采集與分析。將各待測化合物和內標峰面積的比值與理論濃度采用一元二次回歸方程（quadratic）擬合，得到權重因子為1/x2。氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的線性方程、相關系數、線性范圍見表3，回歸曲線見圖1、圖2、圖3。氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的定量下限均為25 ng/g，定量下限的信噪比分別為77.2、53.5、320.4（圖4、圖5、圖6），符合信噪比（RSN）>10作為定量下限的要求。當信噪比為3時，最低檢測限分別為2.50、2.50、1.25 ng/g。

2.5加標回收率

3種藥物在20、50、100 μg/kg添加水平下的平均回收率為93.26%～97.25%，RSD為0.47%～1.83%（表4）。可見，本方法可滿足鴨肉中同時檢測氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的要求。

2.6給藥動物肌肉中藥物濃度的測定

[CM（24]給藥樣品經處理后進樣，通過Analyst 1.4.2軟件計算，[CM）]肌肉樣品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的平均濃度分別為735、1 470、1 540 ng/g（圖7）。

3結論與討論

本研究建立了應用HPLC-MS/MS檢測禽肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考殘留的檢測方法，采用負離子選擇反應監測模式同時檢測3種化合物。本方法僅取0.5～1.0 g樣品，經50%乙腈高速勻漿后，取50 μL勻漿樣品，加入5 μL乙腈，以7-羥基雙香豆素為內標。無需脫脂和固相萃取等操作，且無需氮吹濃縮。該方法簡單易行，出峰時間為1～3 min，分析快速，且方法的最低檢測限低于國家氯霉素類殘留最低檢測限（100 ng/g）。該方法的回收率和準確率高，完全可滿足禽肉中氯霉素類藥物的殘留確證。

有關鴨肉中氯霉素類藥物殘留檢測的報道很少，但在其他有關動物組織中，氯霉素類藥物殘留檢測方法的報道很多。陶昕晨等采用HPLC-MS/MS建立蝦肉和豬肉中氯霉素類藥物的多殘留檢測方法，以2%堿性乙酸乙酯提取，其平均回收率為78.17%～99.86%，但保留時間為2.63～3.72 min[13]；本試驗的分析時間更短，僅為1～2 min，且樣品處理方法更為簡單。

[HS2][HT8.5H]參考文獻：[HT8.SS]

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