中華石蝴蝶組織培養及試管開花誘導

王一諾++李翠++肖冬++李林軒++韋瑩++王曉峰++韋坤華

摘要：以中華石蝴蝶（Petrocosmea sinensis Oliv.）的幼嫩葉片為外植體，以MS為基本培養基，研究植物生長調節劑多因素組合對中華石蝴蝶繼代增殖和生根培養的影響，并誘導獲得的無菌苗在試管中開花。結果顯示，不同的生長調節劑配比對中華石蝴蝶繼代培養和生根培養的影響不同，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L IAA利于芽繼代增殖，MS+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭適于誘導生根獲得再生植株，MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA利于試管苗開花，持續繼代可抑制中華石蝴蝶的試管開花。

關鍵詞：中華石蝴蝶；組織培養；繼代增殖；生根培養；試管開花

中圖分類號： S682.1+90.4+3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0098-03

中華石蝴蝶（Petrocosmea sinensis Oliv.）為苦苣苔科石蝴蝶屬多年生草本植物，產于云南北部、四川和湖北西部，生于低山陰處的石上。目前，苦苣苔科（Gesneriaceae）植物在全世界約有140屬2 000余種，中國有58屬（其中28屬特產中國）463種，從遼寧到海南均有分布，多數屬、種分布于云南、廣西、廣東等省（區）熱帶及亞熱帶石灰巖的陡崖上[1]。苦苣苔植物很多品種花色艷麗，極具觀賞價值。此外，芒毛苣苔屬、非洲紫苣苔屬、大巖桐屬，中國產的吊石苣苔、螞蟥七、牛耳朵等具有藥用價值[2]。由于許多苦苣苔科植物分布區域狹窄，對生長條件要求苛刻，加上民間的過度采挖，使許多苦苣苔科植物的野生資源瀕臨絕種[3]。

中華石蝴蝶不僅花色美麗，可作為觀賞花卉，同時也是一種中藥材，以全草入藥，具有清熱解表、健脾和胃等功效，可用于治療感冒、小兒疳積等癥狀[4]。本研究通過對中華石蝴蝶組織培養的技術研究，探索行之有效的中華石蝴蝶繁殖技術并通過仿生栽培，可以對其野生資源進行有效保護。試管開花是利用組織培養技術使組培植物在離體環境下開花的一種現象，不受季節的限制，可以通過控制相應的條件，讓組培植物進入開花時期[5]。中華石蝴蝶的試管開花可為人們對鮮花日益增長的需求提供廣闊的市場。因此，利用植物組織培養技術對中華石蝴蝶進行培養并對其試管開花作初步探究，研究其開花機制，具有重要的現實意義和應用價值。本研究在中華石蝴蝶組織培養的基礎上，進行無菌苗的試管開花誘導，可為研究其花期生理和調控提供基礎資料。

1材料與方法

1.1材料

中華石蝴蝶采取廣西壯族自治區藥用植物園科研基地內健壯無病害的植株，選取其幼嫩的葉片為外植體。

1.2外植體消毒

將采回的外植體在流水下緩慢沖洗，并用軟毛刷輕輕擦拭去除表面的污垢，放入燒杯中，用適量濃度洗潔精溶液浸泡15 min后，再用流水沖洗10 min。將材料移至超凈工作臺上，用75%乙醇表面消毒15 s后用無菌水沖洗2次，再用0.1%氯化汞溶液浸泡8 min，最后用無菌水浸泡沖洗5次，將氯化汞溶液徹底洗出。在無菌器皿中將外植體與消毒液接觸的傷口切除，接種于誘導培養基中，以誘導出的叢生芽作為試驗材料。

1.3繼代增殖

取無菌中華石蝴蝶叢生芽，接入添加不同濃度植物生長調節劑6-BA、NAA、IAA的MS+30 g/L蔗糖+4.0 g/L瓊脂的培養基中，調節培養基的pH值為5.8，設置其培養條件為平均光照度1 500～2 200 lx，光照時間12 d/h，培養溫度（25±3） ℃，考察不同培養配方對中華石蝴蝶繼代的影響。

1.4生根培養

挑取繼代培養得到的增殖苗，單切叢生芽為單芽，接入添加不同濃度的植物生長調節劑6-BA、NAA的MS+蔗糖 30 g/L+瓊脂4.0 g/L培養基中，另一部分接入添加1 mg/L活性炭的上述培養基中生根，設置其平均培養條件為光照度1 500～2 200 lx，光照時間12 d/h，培養溫度（25±3） ℃，考察不同培養基配方對中華石蝴蝶生根率的影響。

1.5植物生長調節劑對中華石蝴蝶誘導開花的影響

選取繼代增殖的無菌苗，接種到MS培養基以及添加6-BA、NAA的MS培養基上，每種培養基中含有30 g/L蔗糖、4.0 g/L 瓊脂，培養條件為平均光照度1 500～2 200 lx，光照時間12 d/h，培養溫度（25±3） ℃，在培養期間觀察植物的生長情況并記錄試驗結果。

1.6繼代培養對中華石蝴蝶試管開花的影響

設計1組繼代試驗，中華石蝴蝶試管苗每40 d轉接至繼代培養基中繼代培養1次，比較連續繼代、只繼代1次對中華石蝴蝶試管開花的影響。

2結果與分析

2.1繼代增殖

切取誘導出的芽，將其接種在不同外源激素配比的繼代增殖培養基中，每天觀察接入芽發生的微小變化，大概10 d后開始有新芽出現，一段時間后芽苗的數量慢慢增多，于60 d后統計芽的增殖系數。表1表明，MS+1.0 mg/L 6-BA+02 mg/L NAA+0.1 mg/L IAA培養基中華石蝴蝶的長勢最好，增殖倍數高，芽粗壯，葉色翠綠，部分出現幼根但比較弱。從試驗結果可以看出，中華石蝴蝶的增殖率會受到6-BA含量的影響，在0～1.0 mg/L范圍內，在低含量時芽的生長速度相對較慢；隨著6-BA含量的增大，芽的增殖倍數不斷增大，有效芽苗的數量也不斷增加；但當6-BA含量大于 1.0 mg/L，達到1.5 mg/L時，芽苗相對長勢比較弱，部分出現玻璃化現象，有效的芽苗數量減少，表明6-BA含量過高反而抑制了中華石蝴蝶的生長。較好的芽苗生長情況見圖1。

2.2生根培養

將繼代培養得到的增殖苗單切叢生芽為單芽接入不同植物生長調節劑含量的生根培養基中，一部分接入添加 1.0 mg/L 活性炭的上述培養基中。表2結果表明，中華石蝴蝶在上述培養基中均能生根，但在MS+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭培養基上生根效果最好，植株長勢較好，平均的生根數為18條/株，平均根長3.62 cm，生根率達到100%，生根苗相對粗壯，利于試管苗的移栽。其中IBA影響苗的生長，當培養基中只添加IBA時生根數較少，根較細、弱，質量不好。NAA、活性炭對生根有促進作用，兩者同時配合使用時，生根效果最好（圖2），但NAA含量過高，對生根也會產生抑制作用。

2.3不同植物生長調節劑對中華石蝴蝶試管開花的影響

以MS培養基為空白對照，剪取長勢良好的中華石蝴蝶無菌試管苗，接種于研究試管開花的培養基中，比較在基本培養[CM（25]基中添加6-BA、NAA激素對中華石蝴蝶試管開花的影響。表3表明，中華石蝴蝶在不添加任何激素的MS培養基中能夠正常生長，但不能進行試管內開花，培養一段時間后，試管苗會出現黃化的現象；在MS培養基中分別添加激素6-BA、NAA，試管內開花率明顯高于對照培養基MS，在只添加激素6-BA的基本培養基中，花序比較纖細、幼弱，而當同時添加2種激素時，中華石蝴蝶試管開花率最高，花開得更大、更伸展，花色相對艷麗（圖3）。結果說明，6-BA、NAA激素配合使用，對中華石蝴蝶的試管開花有促進作用。

2.4繼代培養對中華石蝴蝶試管開花的影響

設計1組試驗，比較不同繼代培養次數對中華石蝴蝶試管開花的影響。分別剪取中華石蝴蝶持續繼代、只繼代1次的無菌試管苗，接種在利于試管開花的MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養基中，連續培養3個月，觀察并記錄試驗結果。結果顯示，減少繼代培養的次數利于試管開花，繼代1次的中華石蝴蝶的開花率明顯高于持續繼代的，表明持續繼代會抑制中華石蝴蝶的試管開花。

3討論與結論

在組織培養的過程中，培養基中不同生長調節劑的配比是誘導植物產生芽、根的關鍵因素[6]。不同的植物在組織培養中所需要激素的種類和含量是不同的，同大多數苦苣苔科植物一樣，培養基中細胞分裂素、生長素的含量和配比對中華石蝴蝶組織培養中芽的增殖和生根起著決定性的作用。6-BA 是目前使用廣泛的細胞分裂素，其含量在合適的范圍內才有利于植物的生長，過高會抑制植物生長而出現玻璃化，過低則不利于芽苗增殖。IAA是促進細胞分裂和生長的內源性激素，在中華石蝴蝶的組織培養過程中，添加6-BA的同時配合NAA、IAA使用，并使其達到合適的比例，才能達到較為理想的效果。在本試驗中，中華石蝴蝶的繼代增殖在MS+10 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L IAA培養基中較好，增殖倍數高，芽苗粗壯且顏色翠綠。在培養基中添加活性炭可有效防止褐變，提供生根的暗環境，降低培養基中的鹽離子濃度或吸附利于生根的物質[7]。中華石蝴蝶在添加活性炭的MS+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭培養基中生根率達到100%。

中華石蝴蝶在MS培養基中可以生長但不能進行試管開花，說明激素是中華石蝴蝶開花所需要的條件，在培養基中加入6-BA可以促進開花，因為植物在開花分化時，細胞分裂素是必不可少的[8]。當培養基中只添加單一的激素時，誘導試管開花率相對都比較低，在試驗中發現，6-BA配合使用一定量的生長激素NAA時能使試管開花率提高。這也進一步說明細胞分裂素與生長素的組合使用可產生更利于中華石蝴蝶試管開花的交互作用效果。本試驗成功誘導了中華石蝴蝶試管開花，但開花率仍需要進一步提高，關于其開花的調控機制尚須深入研究。

[HS2][HT8.5H]參考文獻：[HT8.SS]

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[8]桂毓，李雙躍，劉艷軍，等. 紫蘇草試管開花的研究[J]. 天津農業科學，2014，20（11）：5-8.