轉(zhuǎn)Cry5 Aa基因棉花品系的遺傳穩(wěn)定性研究

王峰　周仲華

摘要：為檢測(cè)轉(zhuǎn)Cry5Aa基因棉花品系的遺傳穩(wěn)定性，為品種安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)，本研究結(jié)合大田性狀比較、卡那霉素檢測(cè)和PCR分子檢測(cè)，研究轉(zhuǎn)Cry5Aa基因棉花品系雜交后代遺傳特性和群體遺傳特性的穩(wěn)定性，結(jié)果表明：F1代均為抗性個(gè)體，F(xiàn)2代正反交組合抗性分離比例均接近3：1，表明外源基因?yàn)轱@性并穩(wěn)定插入到基因組中，說(shuō)明JX0010品系抗蟲(chóng)性狀純合度高，性狀一致性好。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因；Cry5Aa；棉花；遺傳穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)：S562.035 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095—3143（2016）06—0003—04

DOI：10.3969/j.issn.2095-3143.2016.06.001

0引言

從20世紀(jì)80年代初開(kāi)始，育種學(xué)家應(yīng)用分子生物學(xué)手段，將外源抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物體內(nèi)以期獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)品種。1987年Agracetus公司第一次以柯字312為受體培育成功遺傳工程棉，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所郭三堆等，1992年通過(guò)人工合成（Bt）GFM-CryIA殺蟲(chóng)基因和能在棉花體內(nèi)高效表達(dá)的調(diào)控元件序列，培育成功擁有自有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品種并在全國(guó)大力推廣，目前我國(guó)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉占棉花種植面積的一半以上。但是，含Cryl4單價(jià)抗蟲(chóng)基因的棉花品種在我國(guó)棉花生產(chǎn)中已推廣應(yīng)用10多年，棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt基因耐受性逐年增加，抗性風(fēng)險(xiǎn)已越來(lái)越大。Cry5Aa基因是兼抗鱗翅目害蟲(chóng)及線蟲(chóng)的抗蟲(chóng)基因，本課題組2001年將Cry5Aa基因采用花粉管通道法導(dǎo)人“湘棉12號(hào)”，2002年夏獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉株系，2003年育成轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品系（代號(hào)為JX0010）。作為一個(gè)新的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品系，其遺傳穩(wěn)定性對(duì)于該品系的應(yīng)用具有重要的意義，因此，作者結(jié)合大田性狀比較、卡那霉素檢測(cè)和PCR分子檢測(cè)，研究其雜交后代遺傳特性和群體遺傳特性的穩(wěn)定性，為該品系的應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

棉花遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1、中棉所12號(hào)均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花種質(zhì)資源室提供，湘棉10號(hào)、轉(zhuǎn)Cry5Aa棉花品系JX0010均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所提供。

1.2試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

2007年和2008年分別在湖南省南縣民山頭大木橋二組、華容縣菜市鎮(zhèn)橋頭村五組、常德市鼎城區(qū)牛鼻灘鄉(xiāng)三星村、大通湖區(qū)河壩鎮(zhèn)慶成村、澧縣張公廟五組和湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所校內(nèi)科研基地共6個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行。

1.3雜交測(cè)試

以JX0010、TM-1、湘棉10號(hào)和中棉所12號(hào)為父母本，配制6個(gè)以JX0010正反交雜交組合，組合以A、C、D、E、F、G編號(hào)（見(jiàn)表1）。人工去雄雜交，所得種子種植在指定的試驗(yàn)基地，通過(guò)自交獲得F₂代種子。對(duì)F2代進(jìn)行卡那霉素檢測(cè)，對(duì)卡那霉素檢測(cè)出的陽(yáng)性株再進(jìn)行PCR分子檢測(cè)，確定Cry5Aa基因的遺傳規(guī)律和遺傳穩(wěn)定性。

1.4抗蟲(chóng)基因的PCR檢測(cè)

1.4.1棉花基因組提取及檢測(cè) 參照Paterson，等和張金發(fā)，等的CTAB法從子葉中快速提取棉花基因組DNA，在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢查提取的基因組DNA，經(jīng)溴化乙錠（EB）染色后紫外觀察照相。1.2.2

Cry5Aa基因的PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)總體積為25 uL，其中含有Mg²⁺（25 mM）1.5 uL，dNTPs（10 mM）0.5 uL，上下游引物（10 M）各1 uL，TaqDNA聚合酶（1U/uL）1 uL，10 Reaction buffer 2.5 uL，模板DNA（50ng/uL）1 uL，ddH20 16.5 uL；DNA擴(kuò)增反應(yīng)是在ABl2720 PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序：95T：預(yù)變性4 min，94%變性1 min，55℃退火50 s，72%延伸50 s，經(jīng)30個(gè)循環(huán)，72%延伸10 min，4℃保存，0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2結(jié)果分析

2.1雜種F₁代的測(cè)試結(jié)果

以JX0010為母本的雜種F₁代3個(gè)組合，分別編號(hào)為A、C、D，稱之為正交組合；以JX0010為父本的雜種F₁代3個(gè)組合，分別編號(hào)為E、F、G，稱之為反交組合。各組合在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)科研基地種植1500株，成活1300株左右，定苗1200株。8葉期用1200 ug/ml卡那霉素點(diǎn)涂主莖倒數(shù)第3葉，點(diǎn)涂后5～7 d調(diào)查卡那霉素陽(yáng)性反應(yīng)株。結(jié)果表明：A、E兩個(gè)組合陽(yáng)性株率達(dá)100%，是所有組合中最高的；D、G兩個(gè)組合陽(yáng)性株率略低，分別為99.2%、99.5%；而C、F兩個(gè)組合則達(dá)99.9%。且大田抗蟲(chóng)性正反交各組合之間無(wú)顯著差異（P>0.05），表明F₁代均為抗性個(gè)體，JX0010品系抗蟲(chóng)性狀純合度高，抗蟲(chóng)性狀一致性好。

2.2 F₂代的抗性遺傳分析

雜交F1代自交獲得的F2代種子，6個(gè)組合每個(gè)組合種植480m²，1500株左右，棉株8葉期用卡那霉素（1200 ug/ml）點(diǎn)涂主莖倒數(shù)第3葉，5 d后調(diào)查陽(yáng)性株率。隨后對(duì)陽(yáng)性反應(yīng)株采用Cry5Aa特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，去除假陽(yáng)性株。通過(guò)卡平方檢驗(yàn)分析遺傳率和遺傳穩(wěn)定性。

分析結(jié)果表明：不同親本正反交組合問(wèn)存在差異，但均未達(dá)到顯著水平，其抗蟲(chóng)性基本符合顯性單基因3（抗蟲(chóng)）：1（非抗蟲(chóng)）的遺傳規(guī)律，且組合間穩(wěn)定性較好，以JX0010為母本的正交組合經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)的陽(yáng)性株數(shù)（檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1）與陰性株數(shù)之比為3.13：1，而以JX0010為父本的反交組合其比值為2.97：1，兩者間無(wú)顯著差異（表2）。表明轉(zhuǎn)Cry5Aa基因棉花品系JX0010抗蟲(chóng)性的遺傳穩(wěn)定性好。

2.3 F₁回交一代的抗性分析

A、C、D、E、F、G雜交組合F₁與各自的非抗蟲(chóng)親本回交，共獲得6個(gè)回交一代，種植后于棉株8葉期左右用卡那霉素點(diǎn)涂主莖倒數(shù)第3葉，卡那霉素點(diǎn)涂濃度為1200 ug/ml，5 d后調(diào)查點(diǎn)涂葉片有無(wú)黃顏色斑點(diǎn)，凡無(wú)黃色斑點(diǎn)的植株，記為卡那霉素陽(yáng)性反應(yīng)植株，以卡那霉素陽(yáng)性株除以點(diǎn)涂總株數(shù)計(jì)算出陽(yáng)性株率（結(jié)果列于表3）。表明該基因符合單基因顯性遺傳規(guī)律（1：1）。

3結(jié)論與討論

本研究結(jié)合大田性狀比較、卡那霉素檢測(cè)和PCR分子檢測(cè)，研究了轉(zhuǎn)Cry5Aa基因品系雜交后代遺傳特性的分離規(guī)律和群體的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果表明F₁代均為抗性個(gè)體，F(xiàn)₂代正反交組合抗性分離比例（抗蟲(chóng)：非抗）均接近3：1，表明外源基因?yàn)轱@性并穩(wěn)定插入到基因組中，JX0010品系抗蟲(chóng)性狀純合度高，性狀一致性好。

對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物來(lái)說(shuō)，外源基因能否在后代中穩(wěn)定地遺傳和表達(dá)是基因工程技術(shù)實(shí)用化研究中的關(guān)鍵問(wèn)題。在理論上，外源基因一旦整合進(jìn)入受體的核基因，插入的外源基因能在減數(shù)分裂中留存下來(lái)，就能夠穩(wěn)定地通過(guò)有性繁殖傳遞給后代，并保持減數(shù)分裂的穩(wěn)定性。但是，在實(shí)際操作中，常遇到多拷貝與重復(fù)轉(zhuǎn)基因序列造成的基因沉默，使外源基因不能在轉(zhuǎn)基因作物中穩(wěn)定表達(dá)，甚至不表達(dá)。特別是花粉管通道法由于外源基因插入的隨機(jī)性而更易于這種現(xiàn)象的發(fā)生。本研究通過(guò)花粉管通道法獲得了一個(gè)轉(zhuǎn)基因品系，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明外源基因?yàn)轱@性并穩(wěn)定插入到基因組中，為該基因的應(yīng)用提供了較好的支撐。