熊果酸對大鼠血管外膜成纖維細胞增殖的影響

劉盛華　劉小利　李彬　鄒增曉

【摘要】 目的：研究采用MTT法檢測不同濃度的熊果酸對大鼠胸主動脈外膜成纖維細胞增殖的影響。方法：解剖分離SD大鼠的胸主動脈，獲取胸主動脈血管外膜。對血管外膜成纖維細胞進行培養、純化、傳代。采用TGF-β1誘導血管成纖維細胞增殖，用不同濃度的熊果酸抑制細胞增殖，用MTT法檢測不同濃度的熊果酸對TGF-β1誘導血管外膜成纖維細胞增殖的影響。結果：隨著熊果酸濃度的增加，UA組的OD值逐漸減小，血管外膜成纖維細胞的抑制率逐漸增加，且各組UA細胞抑制率比較，差異均有統計學意義（P<0.05），UA3組（UA濃度45 μmol/L）的細胞抑制率作用最強。結論：熊果酸對TGF-β1介導的胸主動脈外膜成纖維細胞增殖具有明顯的抑制作用，該抑制作用隨著熊果酸的濃度增加而增強。

【關鍵詞】 熊果酸； 血管外膜成纖維細胞； 增殖； 再狹窄

Effect of Ursolic Acid on the Proliferation of Adventitial Fibroblasts in Rats/LIU Sheng-hua，LIU Xiao-li，LI Bin，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（06）：006-009

【Abstract】 Objective：To study the effects of different concentrations of ursolic acid on the proliferation of rat thoracic aorta adventitial fibroblasts by MTT assay.Method：The thoracic aorta of SD rats were dissected，and the adventitia of thoracic aorta was isolated.The adventitial fibroblasts were cultured，purified and passaged.TGF-β1 was used to induce the proliferation of vascular fibroblasts，different concentrations of ursolic acid were used to inhibit cell proliferation，MTT method was used to detect the effect of ursolic acid on the proliferation of vascular adventitial fibroblasts induced by TGF-β1.Result：With the increase of ursolic acid concentration，the OD of UA group decreased gradually，the inhibitory rate of adventitial fibroblasts was gradually increased，and the inhibitory rate of UA cells in each group were statistically significant（P<0.05），UA3 group （UA concentration 45 μmol/L） had the strongest inhibitory effect.Conclusion：Ursolic acid significantly inhibit TGF-β1 mediated proliferation of adventitial fibroblasts of thoracic aorta，the inhibitory effect is enhanced with the increase of ursolic acid concentration.

【Key words】 Ursolic acid； Vascular adventitial fibroblast； Proliferation； Restenosis

First-authors address：Guangdong Provincial Corps Hospital of Chinese Peoples Armed Police Forces，Guangzhou 510000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.06.002

冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass graft，CABG）是冠心病患者冠狀動脈再血管化的重要方法，橋血管的通暢率是評價其治療效果最重要的指標。無論是動脈橋還是靜脈橋，再狹窄都與手術操作所帶來的損傷及局部的炎性反應有著重要的關系。術后橋血管內膜、中膜和外膜的增生導致血管重塑是再狹窄的病理學基礎。對于行CABG手術患者的橋血管，術中難免會有一定程度的損傷，在血管損傷后，位于血管外膜的成纖維細胞由“靜止”狀態轉為“激活”狀態，并遷徙至內膜下區域和新生內膜中并增殖[1-2]。本研究采用轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導大鼠胸主動脈外膜成纖維細胞增殖，用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測不同濃度的熊果酸對成纖維細胞增殖的影響，為熊果酸治療冠狀動脈旁路移植術后橋血管再狹窄提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 120 g左右的SD大鼠，購自南方醫科大學實驗動物中心。熊果酸、PBS液、ELISA試劑盒和戊巴比妥鈉購自上海逸術生物科技有限公司。TGF-β1為GenWay Biotech公司產品，MTT、Vimentin抗體、α-SMA抗體和desmin抗體均由武漢賽維爾生物科技有限公司提供。

1.2 大鼠血管外膜成纖維細胞的原代培養 取120 g左右的SD大鼠，腹腔注射0.25%戊巴比妥那40 mg/kg麻醉，頸部脫臼處死，碘伏消毒，解剖取出胸主動脈。PBS液沖洗胸主動脈，將胸主動脈在顯微鏡下分離外膜，再用PBS液沖洗。將胸主動脈外膜剪成1 mm×1 mm大小的組織塊，將其貼于培養瓶底部，放入培養箱中孵育6～8 d。

1.3 大鼠血管外膜成纖維細胞的傳代 待單層細胞長至鋪滿瓶底80%以上時進行細胞傳代。細胞傳代后，24 h后可見細胞重新貼壁生長，將其再傳代。成纖維細胞傳至4～8代后，即可用于細胞實驗。

1.4 血管外膜成纖維細胞的純化 血管外膜經過幾代生長后，成纖維細胞利用較快的生長速度達到自然純化，得到較高純度的成纖維細胞。

1.5 血管外膜成纖維細胞的鑒定 采用細胞免疫熒光技術，利用Vimentin抗體和α-SMA抗體及desmin抗體鑒定細胞。Vimentin抗體陽性同時α-SMA和desmin抗體陰性，便說明為外膜成纖維細胞。

1.6 細胞的凍存 傳代后的細胞融合至80%后進行凍存。離心搜集細胞，將其放入-80 ℃冰箱中保存。

1.7 細胞的復蘇 凍存管放入37 ℃融化，將其放入培養瓶中，再放入孵箱中。

1.8 對血管外膜成纖維細胞增殖能力影響的檢測

1.8.1 細胞實驗分組 空白對照組：單純細胞孔，不作任何干預；TGF對照組：每個細胞孔中加入（TGF-β1 10μg/L）；UA1組：每個細胞孔中加入（TGF-β1 10 μg/L+UA 15 μmol/L）；UA2組：每個細胞孔中加入（TGF-β1 10 μg/L+UA 30 μmol/L）；UA3組：每個細胞孔中加入（TGF-β1 10 μg/L+UA 45 μmol/L）。每組以6個標本計算OD平均值。

1.8.2 MTT法檢測緩釋藥膜對血管外膜成纖維細胞活力的影響 成纖維細胞以每孔6×105個細胞接種于96孔板。培養后加入各組試劑，2 d后棄培養基，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）0.02 mL。經孵育4 h在490 nm波長下用酶聯免疫儀測定吸光值（OD值）。根據以下公式計算成纖維細胞的增值率和抑制率。TGF細胞增值率（%）=（TGF對照組MTT OD值-空白對照組MTT OD值）/空白對照組MTT OD值×100%。UA細胞抑制率（%）=（TGF對照組MTT OD值-UA組MTT OD值）/TGF對照組MTT OD值×100%。

1.9 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件進行分析數據，計量資料數據采用均數±標準差（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗，兩組以上比較采用析因設計的方差分析；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，兩組以上比較采用析因設計的方差分析，取α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

空白對照組的OD值為（0.52±0.04），與TGF對照組的（0.76±0.09）比較，差異有統計學意義（P<0.05），TGF細胞增值率為46.1%。各組血管外膜成纖維細胞MTT的OD值和細胞抑制率比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。UA1組、UA2組、UA3組的OD值和細胞抑制率分別為（0.71±0.03）、（0.65±0.06）、（0.57±0.05）和6.5%、14.4%、25.0%，隨著熊果酸濃度的增加，UA組的OD值逐漸減小，血管外膜成纖維細胞的抑制率逐漸增加，差異均有統計學意義（P<0.05），UA3組（UA濃度45 μmol/L）的細胞抑制率作用最強。

3 討論

盡管臨床上大多數冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的患者會選擇經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）作為首選治療方法，但冠狀動脈旁路移植術仍然是冠狀動脈血運重建最重要的外科方法，尤其是對PCI失敗或PCI術后再狹窄的患者[3-4]。對于冠狀動脈再血管化的方法，橋血管的通暢率是評價其治療效果最重要的指標[5]。術后橋血管內膜、中膜和外膜的增生導致血管重塑是再狹窄的病理學基礎。因此，成纖維細胞的增殖轉化在血管重構的發生發展中扮演著重要的角色。在血管再狹窄的重塑中，血管外膜成纖維細胞（vascular adventitial fibroblast，VAF）在以往的研究中往往被認為只起著支持和營養的作用。越來越多的研究表面，血管外膜成纖維細胞的增殖和遷徙在血管重塑的機制中起著重要的作用[6-7]。當血管發生損傷性病變，如血管張力增加、內皮細胞損傷、高血脂或外膜剝離等，血管外膜成纖維細胞會發生凋亡、增殖，在損傷血管局部釋放血小板衍生因子和TGF-β1等因子的誘導下血管外膜成纖維細胞會發生表型的改變，同時細胞會表達α-SMA，血管外膜成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化進而引起組織的修復與病變血管的重塑[8]。研究表明在局部發生炎癥時，血管外膜成纖維細胞的表型改變、細胞增生以及遷徙并釋放細胞外基質并形成新的外膜。同時，血管外膜成纖維細胞會分泌高于正常水平的MMPs，該酶能降解細胞外基質，并促進局部細胞的遷徙[9]。血管外膜主要含有血管外膜成纖維細胞、脂肪細胞和膠原組織。血管外膜成纖維細胞作為多種炎性細胞因子所作用的靶細胞，同時也能分泌相關的免疫調節因子參與部分細胞生長的調節過程。研究熊果酸是否具有抑制血管外膜成纖維細胞增殖的影響，可以對血管外膜成纖維細胞的遷徙、增殖、膠原合成與分泌及細胞表型轉化為重要病理學基礎所導致的血管再狹窄的治療提供重要的實驗依據。

熊果酸廣泛存在于自然界中，分子式為C30H48O3，又名烏索酸、烏蘇酸。其為脂溶性物質，易溶于甲醇、吡啶等物質，可透過細胞膜發揮藥理作用，具有明顯的抗炎、抗氧化、抗腫瘤等較為廣泛的生物學作用[10-12]，目前已廣泛用于化妝品及醫藥行業。研究表明，熊果酸能夠較強地抑制體外培養增殖期的血管內皮細胞的血管形成，其抑制程度與熊果斷的濃度呈正相關[13]。熊果酸具有抑制NF-κB所介導的炎癥反應所導致的細胞增生、氧化、細胞凋亡的作用[14]。文獻[15]研究表明，熊果酸可能通過抑制炎癥反應的中心物質NF-κB的活化，進而抑制MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α的表達。總之，熊果酸可以抑制術后靜脈橋血管的狹窄[16]。熊果酸抑制術后靜脈橋血管再狹窄的是由抑制局部炎癥，誘導細胞凋亡等多種因素作用的結果。目前對于熊果酸誘導細胞凋亡的作用多集中在抑制腫瘤細胞上[17]。研究表明，熊果酸具有誘導肺癌細胞PGCL3細胞的凋亡，抑制此類細胞株運動、侵襲和粘附的作用[18]。Baek等[19]研究證實，熊果酸能顯著抑制人白血病細胞HL-60的增殖，誘導其凋亡，該作用具有明顯的濃度依賴性。TGF-β具有能使在瓊脂中生長的成纖維細胞發生表型的轉化，從而起到促使細胞生長和分化、增殖的作用。研究表明，TGF-β1可促進血管外膜成纖維細胞的增殖，并且具有明顯的劑量依賴關系。10 μg/L TGF-β1促進增殖作用最為明顯[20]。

本研究表明，熊果酸對TGF-β1介導的大鼠胸主動脈血管外膜成纖維細胞增殖具有明顯的抑制作用，該抑制作用隨著熊果酸的濃度增加而增強。因此熊果酸不但具有抑制血管內膜、中膜細胞增殖的作用，也具有抑制血管外膜成纖維細胞增殖的作用。本研究完善了熊果酸抑制血管再狹窄的機制，可以為熊果酸抑制冠狀動脈旁路移植術后橋血管再狹窄提供實驗依據。

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（收稿日期：2017-01-20） （本文編輯：張爽）