超聲靶向微泡破壞聯合脂質體介導pSilencer 3.1-SATB1基因轉染前列腺癌細胞效果觀察

張娟娟，陳英紅，林旭紅

(河南大學淮河醫院，河南開封475000)

超聲靶向微泡破壞聯合脂質體介導pSilencer 3.1-SATB1基因轉染前列腺癌細胞效果觀察

張娟娟，陳英紅，林旭紅

(河南大學淮河醫院，河南開封475000)

目的 探討超聲靶向微泡破壞(UTMD)聯合脂質體介導的沉默特異性核基質蛋白1基因(pSilencer3.1-SATB1)對人前列腺癌細胞轉染的效果。方法 體外培養人前列腺癌雄激素非依賴型細胞株DU145，分為對照組、微泡組、超聲組、超聲+微泡組、脂質體組、超聲+微泡+脂質體組。微泡組加入適量微泡，超聲組僅給予超聲輻照，超聲+微泡組加入微泡后予以超聲輻照，脂質體組加入脂質體，超聲+微泡+脂質體組加入微泡、脂質體后予以超聲輻照，對照組不做任何處理。24 h后采用流式細胞儀觀察各組增強型綠色熒光蛋白(EGFP)表達，并檢測EGFP熒光細胞的比例，計算基因轉染率以評價轉染效果。結果 熒光顯微鏡下，超聲+微泡+脂質體組可見大量EGFP表達，明顯多于其他各組。對照組、微泡組、超聲組、超聲+微泡組、脂質體組、超聲+微泡+脂質體組基因轉染率分別為0.18%±0.09%、0.25%±0.11%、1.14%±0.13%、2.96%±0.16%、3.99%±0.12%、7.16%±0.17%，超聲+微泡+脂質體組的基因轉染率高于其他各組(P均<0.05)。結論 UTMD可增強脂質體介導質粒pSilencer3.1-SATB1對DU145細胞的轉染效果，提高轉染率，為前列腺癌治療的研究提供了一個新的途徑。

超聲靶向微泡破壞；基因轉染；脂質體；質粒；特異性核基質蛋白1基因；前列腺癌

近年來，惡性腫瘤的基因治療成為研究的熱點，如何安全、高效地將目的基因靶向載入腫瘤細胞，是目前基因治療領域研究的關鍵問題。脂質體作為目前最常用的非病毒性載體，雖克服了病毒性載體具有的免疫原性和致突變性，但因具有轉染率較低及無靶向性等缺點,使其應用一定程度的受限[1]。超聲靶向微泡破壞(UTMD)是一種新型、安全的靶向基因轉染方法，能提高裸DNA及重組基因載體對細胞的轉染效果[2,3]。目前，對于UTMD聯合脂質體對前列腺癌細胞轉染的效果尚未見報道。2016年 6～12月，我們將UTMD與脂質體聯合，應用于沉默特異性核基質蛋白1基因(pSilencer3.1-SATB1)在前列腺癌DUl45細胞的轉染，旨在構建一種安全、高效、特異的基因治療導入系統，為前列腺癌的治療研究提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 人前列腺癌雄激素非依賴型細胞株DU145(上海中科院生物研究所細胞庫)。RPMI1640培養液(Gibco公司)；無噬菌體、低內毒素胎牛血清(杭州四季青生物技術有限公司)；0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)；SonoVue微泡(Bracco公司)；脂質體Lipofectamine2000(Invitrogen)；pEGFP-C1-pSilencer3.1-SATB1質粒、pSilencer3.1-SATB1引物(上海生物工程股份有限公司)；質粒小量提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)。超聲治療儀(深圳威爾德電子有限公司)。

1.2 細胞培養 DU145細胞在37 ℃、5%CO2條件下，于培養瓶內常規培養，細胞培養液為含 10%胎牛血清的 RPMI1640培養液。

1.3 質粒提取和微泡制備 通過大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化可表達增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的質粒pEGFP-C1-pSilencer3.1-SATB1，按質粒小量提取試劑盒(TIAN prep Mini Plasmid Kit)說明書的要求提取、純化質粒；測量質粒濃度和純度，待A260∶A280≥1.8時用于實驗。根據說明書制備聲諾維微泡，反復振蕩使之成為懸浮液。將質粒與微泡混合(每分鐘震蕩1次)，于4 ℃恒溫冰箱中保存15 min，備用。

1.4 細胞分組及轉染處理 將生長良好的DU145細胞用0.25%胰酶消化計數后，以無血清的RPMI1640制成單細胞懸液，調節細胞懸液密度在1×105～3×105/mL。將細胞分為6組，分別為對照組、微泡組、超聲組、超聲+微泡組、脂質體組、超聲+微泡+脂質體組。每組設3孔，實驗重復5次。將各組細胞懸液分別緩慢加入無菌聚乙烯管內，各組中均加入等量的細胞懸液及質粒，試劑加入均在無菌超凈臺里完成。微泡組加入20%的微泡；超聲組予以適宜強度的超聲輻照；超聲+微泡組加入20%的微泡濃度后予以適宜強度的超聲輻照；脂質體組按照lipofectamin2000轉染的步驟加入脂質體；超聲+微泡+脂質體組加入相應量的脂質體及20%的微泡濃度后，予以適宜強度的超聲輻照；對照組不做任何處理。試劑加入完畢后，聚乙烯管采用無菌封口膜封口，室溫下靜置30 min，于超聲輻照前將細胞懸液輕柔搖勻。超聲輻照時，探頭固定于不銹鋼支架上，使輻射面垂直朝上，然后將裝有細胞懸液的聚乙烯管倒置于超聲探頭表面，為避免兩者之間留有氣泡，用超聲耦合劑予以填充。超聲輻照參數設置為頻率1 MHz、輻照功率1.0 W/cm2、持續時間30 s、占空比20%。整個實驗過程避光操作。

1.5 基因轉染率測算 細胞輻照完成后去除封口膜，立即將細胞懸液轉移于6孔培養板，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中孵育4 h，換液后繼續培養24 h，于熒光顯微鏡下觀察細胞內EGFP的表達情況并攝片保存。因重組基因可表達EGFP，故采用流式細胞儀檢測熒光細胞的比例，以EGFP的表達反映DU145細胞中pSilencer3.1-SATB1的表達量，計算基因轉染率以評價轉染效果。

2 結果

熒光顯微鏡下，對照組、微泡組均未觀察到綠色熒光；超聲組可見極少綠色熒光；超聲+微泡組、脂質體組均可見較多綠色熒光，但后者較前者綠色熒光明顯；超聲+微泡+脂質體組綠色熒光最強，可見大量EGFP表達，明顯多于其他各組。對照組、微泡組、超聲組、超聲+微泡組、脂質體組、超聲+微泡+脂質體組基因轉染率分別為0.18%±0.09%、0.25%±0.11%、1.14%±0.13%、2.96%±0.16%、3.99%±0.12%、7.16%±0.17%，超聲組、超聲+微泡組、脂質體組、超聲+微泡+脂質體組基因轉染率均高于對照組，超聲+微泡組、脂質體組、超聲+微泡+脂質體組基因轉染率均高于超聲組，脂質體組、超聲+微泡+脂質體組基因轉染率均高于超聲+微泡組，超聲+微泡+脂質體組基因轉染率高于脂質體組(P均<0.05)。

3 討論

前列腺癌作為老年男性泌尿系統常見的惡性腫瘤之一，其發病率逐年升高，尤其是在歐美地區高居男性惡性腫瘤的首位，其病死率僅次于肺癌[4]。在我國，隨著人口的老齡化、飲食結構和生活方式的改變以及診斷水平的提高，前列腺癌的發生亦越來越常見，已成為影響50歲以上男性人群健康的重要因素之一。近年來，隨著分子生物學的發展以及相關生物技術的應用，對前列腺癌發生發展分子機制的認識逐步深入，對前列腺癌尤其是激素非依賴性前列腺癌的基因治療研究已成為熱點。

SATB1是一種組織特異性表達的核基質結合蛋白，在免疫調節、腫瘤轉移和凋亡等方面起著重要作用，其主要機制是參與染色質高級結構的形成和調控組織特異性基因的表達。國內外研究[5,6]發現，SATB1基因不僅在前列腺癌組織中高表達，同時其表達水平與前列腺癌的臨床分期及預后密切相關。Mao等[7]研究顯示，體外沉默SATB1基因后可抑制前列腺癌DU145細胞株的增殖。因此，SATB1對于前列腺癌是一個良好的生物標志物和治療靶點。如何將治療性重組基因pSilencer3.1-SATB1成功轉入DU145細胞，是發揮基因沉默SATB1治療前列腺癌的前提，該轉染過程需依次克服細胞外傳輸、細胞攝取和細胞內傳輸的3個障礙。脂質體作為目前最常用的非病毒載體，可與DNA形成脂質體-基因復合物，經胞飲作用將基因導入細胞內，易于制備及大量生產，但具有一定的細胞毒性，在活體內轉染率較低。雖然脂質體轉染的安全性、可控性較高，但由于其克服上述3個障礙的能力有限，且在血清和組織中不穩定，從而導致體內轉染基因效率較低；除此之外，脂質體轉染還具有基因傳輸無靶向性的缺陷。因此，尋找一種既能增強脂質體轉染，又能提高其轉染靶向性的遞送系統，對于擴展脂質體轉染的應用具有重要意義。

UTMD是一種新型的安全、易控的轉染方式，在一定強度的超聲輻照下，微泡在指定的靶向部位發生“爆破”，其間產生的沖擊波、微射流等可使細胞膜通透性增高，有利于DNA分子穿透；此外，超聲波的能量以及微泡破裂時向細胞內傳送的震蕩波還可促進DNA從細胞的內吞泡逸出并進入細胞核，上述效應疊加在一起，可以提高基因在不同細胞中的轉染[10～13]。但就目前而言，與脂質體轉染相比較，其轉染率明顯偏低。本研究發現，超聲+微泡組的轉染率低于脂質體組，與大多數研究結果類似，提示雖然UTMD具有較高的安全性、靶向性，但其轉染效率與傳統的脂質體轉染相比仍有一定的差距，因此如何做到安全、高效、靶向地轉染目的基因，一直是基因治療研究的熱點與難點。

近年研究發現，脂質體與UTMD聯合應用時，不僅能降低脂質體的用量，減小其細胞毒性，還能提高其轉染功效及靶向性。UTMD在增強脂質體轉染方面，有其獨特的優勢，既對人體不產生不良反應，又易于調控，能針對不同細胞類型采取適宜的超聲強度及微泡濃度。此外，還能使聲束聚焦于特定范圍，減少對非病變組織的損傷，為未來臨床應用中疾病的針對化、個性化治療提供了理論基礎。近年研究[8～10]證實，UTMD不僅能提高脂質體轉染的效率，而且還可以提高其轉染的靶向性。Feril等[11]研究發現，單純超聲輻照就能增強脂質體轉染，可能是通過提高脂質體轉染克服上述基因轉入過程3個障礙的能力，即增強了細胞對復合物及細胞核對DNA的攝取能力，抑制了細胞對DNA的胞吐作用。而加入微泡造影劑后，其作為一種人為空化核[12]，能夠使超聲產生空化效應的能量閾值明顯降低，從而達到增強空化效應，導致基因更易通過高通透性的細胞膜進入靶細胞，進而促進脂質體轉染的目的。但是,目前大多數實驗研究的是兩者對報告基因pEGFP-C1/pEGFP-N1的聯合增效作用，對治療性重組基因的研究較少，且研究靶細胞多為肝癌細胞、乳腺癌細胞等，關于前列腺癌細胞的報道較少。本研究將UTMD聯合脂質體應用于增強pSilencer3.1-SATB1基因在前列腺癌DU145細胞中的轉染能力，發現超聲+微泡+脂質體組基因轉染率最高，明顯高于脂質體組及超聲+微泡組，進一步證實UTMD可以顯著增強脂質體轉染重組質粒的效率。

[1] Check E. Second cancer case halts gene-therapy trials[J]. Nature, 2003,421(6921):305.

[2] Sirsi SR, Borden MA. Advances in ultrasound mediated gene therapy using microbubble contrast agents[J]. Theranostics, 2012,2(12):1208-1222..

[3] Duvshani EM, Baruch L, Kesselman E, et al. Therapeutic ultrasound-mediated DNA to cell and nucleus: bioeffects revealed by confocal and atomic force microscopy[J]. Gene Therapy, 2005,13(2):163-172.

[4] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2015,63(1):11-30.

[5] Shukla S, Sharma H, Abbas A, et al. Upregulation of SATB1 is associated with prostate cancer aggressiveness and disease progression[J]. PLoS One, 2013,8(1):e53527.

[6] 曹成松,毛立軍,王軍起,等.前列腺癌轉移與特異性核基質結合區結合蛋白-1[J].中華實驗外科雜志,2013,30(6):1174-1176.

[7] Mao L, Yang C, Li L, et al. Replication-competent adenovirus expressing TRAIL synergistically potentiates the antitumor effect of gemcitabine in bladder cancer cells[J]. Tumor Biology, 2014,35(6):5937-5944.

[8] Suzuki R, Takizawa T, Negishi Y, et al. Gene delivery by combination of novel liposomal bubbles with perfluoropropane and ultrasound[J]. J Control Release, 2007,117(1):130-136.

[9] Un K, Kawakami S, Suzuki R, et al. Enhanced transfection efficiency into macrophages and dendritic cells by a combination method using mannosylated lipoplexes and bubble liposomes with ultrasound exposure[J]. Hum Gene Ther, 2009,21(1):65-74.

[10] 丁璐,陳云超,劉曉玲,等.超聲微泡破裂法聯合陽離子脂質體介導基因轉染的實驗研究[J].中華超聲影像學雜志,2013,22(8):691-695.

[11] Feril LB Jr, Ogawa R, Kobayashi H, et al. Ultrasound enhances liposome-mediated gene transfection[J]. Ultrason Sonochem, 2005,12(6):489-493.

[12] Geis NA, Katus HA, Bekeredjian R. Microbubbles as a vehicle for gene and drug delivery: current clinical implications and future perspectives[J]. Curr Pharm Des, 2012,18(15):2166-2183.

[13] 丁尚偉,張艷容,吳文謙,等.不同轉染方式介導基因轉染效果的評價[J].中華超聲影像學雜志,2014,23(4):349-352.

Ultrasound-targeted microbubble destruction enhances transfection efficiency of liposome-mediated plasmid pSilencer3.1-SATB1 to DU145 cells

ZHANGJuanjuan,CHENYinghong,LINXuhong

(HuaiheHospitalofHenanUniversity,Kaifeng475000,China)

Objective To investigate the effects of ultrasound-targeted microbubble destruction (UTMD) combined with liposome-mediated silencing specific nuclear matrix protein 1 gene (pSilencer3.1-SATB1) on transfection of human prostate cancer DU145 cells.Methods The DU145 cells were cultured in vitro and divided into 6 groups: the control group, microbubble group, ultrasound group, ultrasound+microbubble group, liposome group, and ultrasound+microbubble+liposome group. The control group did not do any treatment, the microbubble group was added with the appropriate amount of microbubbles, the ultrasound group only

ultrasonic irradiation, the ultrasound+microbubble group was added with microbubbles, followed by ultrasonic irradiation, the liposome group was added with liposome, and the ultrasound+microbubble+liposome group was added with microbubbles and liposomes, followed by ultrasonic irradiation. After 24-hour treatment, the expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP) was observed by flow cytometry, the percentage of EGFP fluorescent cells was detected, and the transfection efficiency was evaluated.Results Fluorescence microscopy showed that the expression of green fluorescent protein in the ultrasound+microbubble+liposome group was numerous, which was significantly higher than that of the other groups. The transfection efficiencies of the control group, microbubble group, ultrasound group, ultrasound+microbubble group, liposome group, and ultrasound+microbubble+liposome group were 0.18%±0.09%, 0.25%±0.11%, 1.14%±0.13%, 2.96%±0.16%, 3.99%±0.12%, and 7.16%±0.17%, respectively, and the transfection efficiency of the ultrasound+microbubble+liposome group was higher than that of the other groups (allP<0.05). Conclusion UTMD can enhance the transfection efficiency of liposome-mediated plasmid pSilencer3.1-SATB1 to DUl45 cells, and improve the transfection efficiency, so it provides a new way for the treatment of prostate cancer.

ultrasound-targeted microbubble destruction; gene transfection; liposome; plasmid; specific nuclear matrix protein 1 gene; prostate carcinoma

張娟娟(1982-)，女，碩士，主治醫師，主要研究方向為腹部及小器官的超聲診斷。E-mail: 542145312@qq.com。

陳英紅(1968-)，女，本科，副主任醫師，主要研究方向為腹部及小器官的超聲診斷及超聲介入診治。E-mail: 17344743@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.30.006

R737.25

A

1002-266X(2017)30-0022-04

2017-03-04)