影響禽流感血凝和血凝抑制試驗的因素及對策

鄭海玲/廣東省汕頭市潮南區動物疫病預防控制中心

影響禽流感血凝和血凝抑制試驗的因素及對策

鄭海玲/廣東省汕頭市潮南區動物疫病預防控制中心

HA-HI作為全球流感監測的常用試驗方法可以用于鑒定流感病毒分離株HA亞型，也可以對禽血清中是否存在抗原亞型相同的免疫抗體進行檢測。這種方法操作簡單、方便、靈敏度高，在基層動物防疫部門得到廣泛應用。但是很多因素會導致HA-HI試驗結果失真，難以取得預期檢測效果，下面將對相關影響因素與對策具體探究。

一、處理與保存血清

1.溶血。很多因素影響下會使溶血形成，比如，注射器清潔不當，容器不干燥或者受到污染；穿刺方法不正確，損傷了組織；長時間的淤血；過快的抽血速度；將血液向容器中注入，未能將針頭取下或者過快的注入速度使大量泡沫產生，久而久之會形成溶血；過于劇烈的震蕩，這些都需要在操作中格外注意。可以在采血時應用一次性注射器，讓血清在注射器中自然析出，可以降低溶血發生率。

2.血清分離。采集完的血液呈45～60o角于室溫（20℃～25℃）下放置約2～3h即可分離出血清，條件允許時可先將采好的血液呈45～60o角于4℃冰箱放置約1h，然后用低速離心機離心3～5min，轉速為3000～5000轉。

3.膠凍樣血清。在采集血樣中，因為血液中存有過多脂肪會出現膠凍樣血清，處理這種血清的方法是應用干凈的玻璃棒或者塑料棒挑起膠凍樣的血清，在管壁上擠壓，直到膠凍樣消除為止，然后快速離心，這樣可以快速獲得檢測用的血清樣。

4.保存血清。血清通常在冰箱中冷藏，5℃為適宜溫度。如果檢測用的樣品需要保存1周，需要放置冷凍箱中。保存好的血清一定要做好標記與封閉處理，避免弄混。有的血清樣品需要反復檢測，就需要多次凍融，這樣將難以確保檢測結果準確。有研究人員將30份抗體水平較高的血清作為試驗樣本，分為①組、②組和③組，①組為被檢測血清反復凍融，②組為檢測抗原，也反復凍融，③組為對照組。3組均做血凝抑制試驗，結果顯示：①組抗體水平較對照組低1個滴度，②組抗體水平較對照組低2個滴度。由此，反復凍融會影響到檢測結果，盡量確保樣品反復凍融次數低于5次，必要時可分裝血清樣品。

二、選用器材

1.微量血凝板。可以重復使用微量血凝板，也可以使用一次性的塑料反應板，有機反應板如果清理不當或者出現破損會使試驗精度降低，由此，在使用反應板過程中按照規定步驟與清洗程序清理，一旦發現有機反應板磨損或者破損需停止使用。而應用一次性塑料反應板則可以不用反復清洗，也不會出現磨損問題。

2.微量移液器。多道與單道微量移液器是兩種類型，在使用微量移液器之前需要鑒定或者校正，按照標準方法使用微量移液器，一定要牢固安裝吸頭，避免安裝后出現脫落、漏氣等情況，用手按壓時力度需要恰當、均勻，液體吸取時需要緩慢進行，然后再緩慢的松開；吸頭管嘴浸入到液面的深度也要控制好，這樣可以將誤差盡量減少。

3.吸頭。非一次性吸頭需要徹底清洗干凈，可使用高溫滅菌法或者超聲波清洗法，使吸頭保持無菌狀態，當前，一次性吸頭使用較多，但是也要檢查好質量，在使用微量移液器時，確保安裝的吸頭管嘴是齊平的。

三、試驗操作

1.緩沖液。可以將 pH=7．2、0．01mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS）作為稀釋液，現用現配，盡量不使用生理鹽水替代緩沖液。

2. 1%紅細胞懸液。紅細胞懸液的配制應用公雞2只或2只以上，通常選擇的公雞無禽流感與其他疫病，如果選用免疫公雞，需要適當將洗滌次數與時間增加，且在紅細胞洗滌時將表面白細胞膜去除，不然將對紅細胞敏感度造成影響。血清來源相同的禽種紅細胞作為試驗血清的來源較為合適，可以將非特異情況消除。

3. 4個血凝單位抗原。血凝試驗先將抗原作為試驗對象，抗原效價則為抗原與紅細胞完全凝集的孔，再按照抗原效價，將4個血凝單位抗原配比成，現用現配，可減少浪費與污染，不能反復凍融，也不能放置在常溫下超過5 h。為了確保4個血凝單位抗原配制準確，可開展回歸試驗在HI試驗前。

4.加樣。試驗過程中將需要檢測的血清、4個血凝單位抗原以及PBS加入，還要加入1%紅細胞懸液。在加樣過程中，需要在使用抗原與紅細胞前搖晃均勻，這樣才能使每個孔中的濃度是相同的，提高試驗精度。不能讓吸頭碰觸到U型或者V型板孔，這是預防交叉污染的重要一步。可以在U型或者V型板底部加樣加物，不能在孔壁上方加樣，還要防止滲出；血清倍比稀釋時，不能將移液器的吸頭隨意調整，始終保持在液面中，避免產生氣泡，保證移液量的準確。

四、結果判定

20℃～28℃的溫度下經過10～25 min就可以將抗原效價與血清抗體滴度讀出，在對結果判讀時，可以適當傾斜微量反應板，傾斜角度為45°左右，凝集完全抑制的表現為：孔底沉淀紅細胞流淌呈淚珠狀，邊緣沒有凝集顆粒聚集。

綜上所述，禽流感血凝與血凝抑制試驗，需要充分考慮以上諸多影響因素，嚴格按照標準操作規范進行，才能為科學防控禽流感提供準確依據。

（略）