遠華蟾毒精對小鼠乳腺癌細胞侵襲的抑制作用及機制

曹珍，高玉雪，徐金媛，王茹燕，李峰，朱學濤，史立宏，呂世軍

(濰坊醫學院，山東濰坊261000)

遠華蟾毒精對小鼠乳腺癌細胞侵襲的抑制作用及機制

曹珍，高玉雪，徐金媛，王茹燕，李峰，朱學濤，史立宏，呂世軍

(濰坊醫學院，山東濰坊261000)

目的探討遠華蟾毒精對小鼠乳腺癌細胞侵襲的抑制作用及其機制。方法將培養好的小鼠乳腺癌細胞4T1隨機分為A、B、C、D組。A組常規培養；B、C、D組于缺氧條件下(37 ℃、5% CO、95% N2)進行培養，同時C、D組分別加入0.1、0.5 μmol/L遠華蟾毒精進行培養。培養0、6、12、24 h采用劃痕實驗檢測細胞遷移能力(遷移距離)，用Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力(穿膜細胞數)，用Western blotting法檢測細胞缺氧誘導因子1α(HIF-1α)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)及磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)蛋白表達。結果不同時點細胞遷移距離D組

乳腺癌；遠華蟾毒精；細胞侵襲；4T1細胞；中藥

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。細胞外基質的降解是腫瘤發生侵襲和轉移的關鍵因素?；|金屬蛋白酶(MMP)是與腫瘤侵襲和轉移關系最密切的一類蛋白水解酶[1，2]。在腫瘤微環境中，缺氧是促進腫瘤增殖侵襲的主要因素。缺氧誘導因子1α(HIF-1α)可介導腫瘤細胞對缺氧條件的反應，其在缺氧條件下才可以穩定表達[3，4]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路是細胞內重要的信號通路之一，參與多種重要生物學過程的調控。其通過影響下游多種效應分子的活化狀態，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，與乳腺癌的發生、發展密切相關[5]。有研究表明，蟾酥可抑制肺癌細胞生長和侵襲，但未證明是其中哪種單體化合物具有該作用[6]。本課題組發現，蟾酥中提取的單體化合物遠華蟾毒精可明顯抑制小鼠乳腺癌細胞的非定向遷移、定向趨化運動和對細胞外基質的侵襲，而其分子作用機制尚不清楚。2015年9月～2016年12月，本研究對此進行了探討。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑來源 小鼠乳腺癌細胞系4T1由濰坊醫學院醫學研究實驗中心提供。遠華蟾毒精購自上海晶都生物技術有限公司、兔抗MMP-2單抗、兔抗MMP-9單抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗HIF-1α單抗、兔抗磷酸化的PI3K及磷酸化的AKT單抗購自美國Santa Cruz公司；RPMI1640培養基和類胎牛血清購自美國Hyclone公司；Transwell小室、細胞培養板購自Sigma公司；Matrigel購自BD公司。

1.2 實驗藥物濃度確定及細胞分組 將4T1細胞于37 ℃、5% CO2條件下常規培養。細胞接種于96孔板常規培養24 h，分別加入濃度0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5 μmol/L遠華蟾毒精再孵育24 h，每孔加入MTT溶液20 μL，繼續孵育4 h，終止培養，用酶聯免疫檢測儀檢測各孔波長490 nm處的吸光度值。以藥物濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制細胞生長曲線。通過細胞生長曲線可見0.5 μmol/L濃度內的遠華蟾毒精對細胞增殖影響較小，大于該濃度時明顯抑制細胞增殖。確定遠華蟾毒精實驗濃度為0.1、0.5 μmol/L。將培養好的細胞隨機分為A、B、C、D組。A組常規培養；B、C、D組于缺氧條件下(37 ℃、5% CO、95% N2)進行培養，同時C、D組分別加入0.1、0.5 μmol/L遠華蟾毒精進行培養。

1.3 4T1細胞遷移能力檢測 采用劃痕實驗。各組細胞在6孔板中培養，每個孔平行劃三道痕。分別于培養0、6、12、24 h在低倍鏡(×100)下拍照，統計每孔不同時間點劃痕距離。實驗重復3次，取平均值。

1.4 4T1細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。取各組細胞，按照文獻[7]進行操作，24 h后將小室置于高倍鏡下觀察拍照，隨機計數5個高倍鏡視野下穿過人工基膜的細胞數。實驗重復3次，取平均值。

1.5 4T1細胞HIF-1α、MMP-9、p-PI3K、p-Akt蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集各組細胞培養24 h，裂解，提取細胞總蛋白，制備凝膠，各組加入等量蛋白后電泳、轉膜、封閉、滴加一抗MMP-2、MMP-9、HIF-1α、p-PI3K、p-Akt孵育過夜，二抗孵育后化學發光劑顯影，曝光。目標蛋白相對表達量=(目標蛋白條帶灰度值-內參蛋白條帶灰度值)/內參蛋白條帶灰度值。

2 結果

2.1 遠華蟾毒精對4T1細胞遷移能力的影響 藥物干預0、6、12、24 h，A組遷移距離分別為(2.6±0.56)、(2.8±0.42)、(3.0±0.37)、(3.3±0.51)μm；B組分別為(3.0±0.43)、(3.4±0.55)、(3.7±0.39)、(3.9±0.48)μm；C組分別為(2.4±0.36)、(2.6±0.33)、(3.0±0.52)、(3.2±0.47)μm；D組分別為(1.5±0.57)、(1.7±0.53)、(1.6±0.49)、(1.8±0.46)μm。不同時點細胞遷移距離D組

2.2 遠華蟾毒精對4T1細胞侵襲能力的影響 藥物干預24 h，A組穿膜細胞數為65個/5個視野，B組為70個/5個視野，C組為50個/5個視野，D組為30個/5個視野。穿膜細胞數D組

2.3 遠華蟾毒精對4T1細胞HIF-1α、MMP-9、p-PI3K、p-Akt蛋白表達的影響 藥物干預24 h，A組HIF-1α、MMP-9、p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量分別為1.0±0.12、1.0±0.09、0.8±0.06、0.7±0.06；B組分別為1.0±0.13、1.8±0.15、4.0±0.22、2.6±0.18；C組分別為0.6±0.05、0.6±0.04、0.5±0.07、0.4±0.09；D組分別為0.2±0.04、0.1±0.03、0.1±0.02、0.2±0.03。HIF-1α、MMP-9、p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量D組

3 討論

研究表明，蟾酥具有確切的抗腫瘤活性，能夠誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞分化，還有逆轉耐藥性、抑制腫瘤血管形成及增強免疫等作用[8，9]。遠華蟾毒精是蟾酥提取物，可抑制癌細胞的生長，使荷瘤小鼠存活時間延長。本品可抑制腫瘤細胞惡液質的產生，亦可抑制惡液質素對正常細胞的影響，從而預防腫瘤患者惡液質。遠華蟾蜍精中的途氧化苦參堿有抗乙型肝炎病毒的作用，可降低乙型肝炎病毒轉基因小鼠肝臟內HBsAg和HBcAg的含量，且對兩者作用一致，無選擇性。氧化苦參堿是一種較強的免疫抑制劑，可以抑制多種炎性因子的釋放，有明確的抗炎作用。本研究發現，遠華蟾毒精可抑制乳腺癌細胞的增殖與侵襲。

研究表明，在人類很多常見的惡性腫瘤和癌前病變組織中均有不同程度的HIF-1表達，而在其相應的正常組織中表達變化并不明顯。HIF-1普遍存在于人和哺乳動物細胞內，常氧下也有表達，但合成的HIF-1蛋白很快即被細胞內氧依賴性泛素蛋白酶降解途徑所降解，只有在缺氧條件下HIF-1才可穩定表達[10]。HIF-1β亞基在細胞質中穩定表達，而HIF-1α亞基在翻譯后即被泛素蛋白酶水解復合體降解。因此，在正常氧飽和度下的細胞中基本檢測不到亞基的表達；而在缺氧狀態下，僅亞基的降解被抑制，1α和β亞基形成有活性的HIF-1α，轉移到細胞核內，調節多種基因的轉錄。因此本研究設計在缺氧環境下培養細胞有利于HIF-1α的穩定表達，經檢測其在缺氧環境下高表達，經遠華蟾毒精干預后HIF-1α表達降低，驗證了遠華蟾毒精對HIF-1α的抑制作用。

MMP是一個大家族，因其需要Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名。MMP幾乎能降解細胞外基質中的各種蛋白成分(明膠、纖維蛋白及基底膜Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型膠原)，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，導致腫瘤細胞浸潤結締組織基質，侵入小血管和淋巴管，可見其在腫瘤侵襲轉移中起關鍵作用，被認為是該過程中主要的蛋白水解酶[11，12]。MMP家族已分離鑒別出26個成員，根據作用底物以及片斷同源性，將MMP分為6類，明膠酶為其中重要的一類。明膠酶主要分為兩個亞型，一種被糖化，為MMP-9；另一種非糖化，為MMP-2。MMP-9與MMP-2在細胞外基質降解中起關鍵作用，因而與乳腺腫瘤侵襲轉移的關系密切[13]。本研究也驗證了MMP-9作為HIF-1α的下游因子在乳腺癌細胞中異常表達，遠華蟾毒精對MMP-9表達有抑制作用。

PI3K/Akt信號傳導通路與乳腺癌發生發展密切相關，且只有在磷酸化時才發揮作用。PI3K磷脂?；际钦婧松锛毎さ慕M成部分，PI3K激活可以調節腫瘤細胞生長、抗凋亡。Akt是一種蘇氨酸/絲氨酸激酶，是PI3K下游的主要效應分子之一，PI3K/Akt信號通路在人類很多惡性腫瘤(乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌和胰腺癌等)中都可以被激活，且乳腺癌中這條信號通路的活化高達70%[14]。本研究檢測乳腺癌細胞中p-PI3K、p-Akt在缺氧環境下表達增加，經遠華蟾毒精干預后表達降低，說明遠華蟾毒精可能通過PI3K/Akt通路發揮作用。

綜上所述，本實驗證實遠華蟾毒精通過PI3K/Akt信號傳導通路抑制HIF-1α 、MMP-9蛋白的表達，從而抑制乳腺癌細胞侵襲轉移。

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InhibitoryeffectofYuanhuatoadpoisonfineoninvasionofmousebreastcancercells

CAOZhen,GAOYuxue,XUJinyuan,WANGRuyan,LIFeng,ZHUXuetao,SHILihong,LYUShijun

(WeifangMedicalUniversity,Weifang261000,China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect and mechanism of Yuanhua toad poison fine on the invasion of mouse breast cancer cells.MethodsThe cultured mouse breast cancer cells 4T1 were randomly divided into groups A, B, C, and D. Cell in the group A

the conventional culture; cells in the groups B, C, and D were cultured under the hypoxic conditions (at 37 ℃, 5% CO and 95% N2); while cells in the groups C and D were added with 0.1 and 0.5 mol/L Yuanhua toad poison fine culture. At 0, 6, 12, and 24 h, the cell migration ability was examined by Scratch test (migration distance); the invasive ability was detected by Transwell invasion test (Number of cells through die); the relative expression levels of HIF-1α, matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), phosphoinositide 3-kinase (PI3K), and p-Akt protein were detected by Western blotting.ResultsThe migration distance of each group at different time points was in the following order: group D< group C< group B< group A, the number of transmembrane cells: group D< group C< group B< group A, the expression of HIF-1α, MMP-9, p-PI3K, and p-Akt protein: group D< group C< group B< group A, and the differences in the above indexes were statistically significant between these two groups (allP<0.05).ConclusionYuanhua toad poison fine can decrease the expression of HIF-1α and MMP-9 through the PI3K/AKT pathway, thereby inhibiting the invasion of breast cancer cells.

breast carcinoma; Yuanhua toad poison fine; cell invasion; 4T1 cells; traditional Chinese medicine

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.006

R737.9

A

1002-266X(2017)37-0018-03

山東省自然科學基金資助項目(H1622)。

曹珍(1991-)，女，在讀碩士，主要研究方向為乳腺癌的侵襲與轉移。E-mail:2425278948@qq.com

呂世軍(1961-)，男，博士，教授，主要研究方向為乳腺癌的侵襲與轉移。E-mail:sjlu@wfmc.edu.cn

2017-06-10)