燕窩的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及其發(fā)展概述

林 釗

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350002）

燕窩的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀及其發(fā)展概述

林 釗

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350002）

基因檢測(cè)方法以其快速、準(zhǔn)確、高效、靈敏的特點(diǎn)在食品的真?zhèn)舞b別中得到廣泛運(yùn)用。文章對(duì)燕窩檢測(cè)中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （polymerase chain reaction，PCR）、實(shí)時(shí)熒光PCR、分子指紋、基因芯片、基因測(cè)序等基因檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，并對(duì)以后的發(fā)展進(jìn)行了展望，以期為研究者提供一定的理論參考。

燕窩；基因檢測(cè)；真?zhèn)舞b別

基因是生物遺傳信息的載體，以脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid， DNA）的形式存在于所有組織和細(xì)胞中。遺傳信息直接決定了生物體的本質(zhì)，所以，通過基因?qū)ι镂锓N進(jìn)行鑒別是權(quán)威和科學(xué)的方法。隨著生物學(xué)的發(fā)展，快速、準(zhǔn)確分析基因信息的技術(shù)方法不斷出現(xiàn)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、實(shí)時(shí)熒光PCR、分子指紋、基因芯片、基因測(cè)序等。由于分子生物學(xué)檢測(cè)方法具有特異性好、靈敏度高以及方便快捷等優(yōu)勢(shì)，因此在真?zhèn)舞b別中也得到了運(yùn)用。

燕窩作為一種唾液和絨羽的混合物，其唾液中口腔上皮細(xì)胞和絨羽的構(gòu)成細(xì)胞，可提供相關(guān)的生物信息。燕窩中糖蛋白存在的主要形式是粘蛋白，不易分離，黃秀麗等[1]利用液相等點(diǎn)聚焦電泳，使燕窩水提蛋白質(zhì)以及丙酮沉淀蛋白質(zhì)無雜質(zhì)干擾，滿足電泳分析的需要。同時(shí)，黃秀麗課題組研究燕窩中的蛋白質(zhì)樣品制備的方法，發(fā)現(xiàn)80%丙酮作為蛋白沉淀劑不僅能有效去除雜質(zhì)，而且分離效果更佳。林潔茹等[2]將SDS-PAGE應(yīng)用于燕窩中蛋白質(zhì)分離，并應(yīng)用等點(diǎn)聚焦電泳實(shí)現(xiàn)燕窩真?zhèn)巫R(shí)別。郭麗麗等[3]將雙向電泳技術(shù)用于燕窩中水溶性蛋白的分離和鑒定。研究人員利用不同的方法對(duì)燕窩及其制品進(jìn)行DNA提取，建立了有效快速的DNA提取方法，為生物方法用于燕窩真?zhèn)螠y(cè)定的發(fā)展提供依據(jù)。

1 PCR技術(shù)及其在燕窩檢測(cè)中的運(yùn)用

PCR技術(shù)是一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，以待擴(kuò)增的兩條DNA鏈為模板，在1對(duì)人工合成的寡核苷酸引物的介導(dǎo)下，通過耐高溫DNA聚合酶的酶促作用，快速特異地?cái)U(kuò)增出特定的DNA片段。隨著科技的發(fā)展，研究人員將PCR技術(shù)大量改進(jìn)，由此產(chǎn)生了一系列相關(guān)PCR技術(shù)方法，其中包括原位PCR、巢式PCR、反向PCR、錨定PCR、多重PCR、不對(duì)稱PCR、重PCR、標(biāo)記PCR、免疫PCR等主要用于定性檢測(cè)的技術(shù)。1996年，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的誕生，PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了從定性到定量的飛躍。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)通過在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過程，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量。

何國(guó)林等[4]設(shè)計(jì)1條具有良好特異性和靈敏度的特異靶向雨燕屬和金絲燕屬細(xì)胞色素基因的TaqMan探針，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)燕窩樣品進(jìn)行檢測(cè)分析；Lin 等[5]建立了以線粒體細(xì)胞色素b基因?yàn)榘袠?biāo)的燕窩遺傳學(xué)分子鑒定方法。通過對(duì)11個(gè)燕窩樣品中線粒體細(xì)胞色素b基因的PCR擴(kuò)增、測(cè)序及序列比對(duì)、聚類分析后，發(fā)現(xiàn)該方法能夠?qū)⒀喔C來源區(qū)分開，同時(shí)認(rèn)為該方法具有用于燕窩真?zhèn)舞b定的可能性。實(shí)時(shí)熒光PCR法以及雙向電泳法作為燕窩測(cè)定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)得到廣泛應(yīng)用，作為分子生物學(xué)鑒定方法可以準(zhǔn)確地檢測(cè)燕窩成分；Wu[6]等將PCR技術(shù)和雙向凝膠電泳技術(shù)應(yīng)用于真?zhèn)伪鎰e中。PCR技術(shù)主要用于評(píng)價(jià)產(chǎn)品中燕窩成分的存在，靈敏度比較高，可檢測(cè)0.5%燕窩含量的銀耳燕窩類加工制品，而雙向凝膠電泳則可確定燕窩蛋白占總蛋白的比例；王鳳云等[7]探究了32種不同品種和產(chǎn)地燕窩的生物基原，對(duì)其中的DNA進(jìn)行提取、擴(kuò)增和測(cè)序后，利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，分析變異位點(diǎn)，計(jì)算Kimura-2參數(shù)遺傳距離，構(gòu)建鄰接（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹，從而鑒別燕窩的基原。結(jié)果表明，NJ系統(tǒng)發(fā)育樹顯示相同生物基原的燕窩物種將聚為1支，其所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性、靈敏性、重復(fù)性和穩(wěn)定性等特點(diǎn)。

2 DNA指紋技術(shù)

DNA指紋技術(shù)建立在DNA分子標(biāo)記基礎(chǔ)上，以生物個(gè)體間核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記（分子標(biāo)記），直接在DNA水平上檢測(cè)生物個(gè)體的差異，是生物個(gè)體在DNA水平上遺傳變異的直接反映。DNA分子指紋技術(shù)種類繁多，包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeats，SSR）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Singlestrand Conformation Polymorphism，SSCP）、變性高效液相色譜（Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC）等技術(shù)。

DNA 指紋技術(shù)主要具有如下優(yōu)點(diǎn)：1.不受組織類別、發(fā)育階段等影響；2.不受環(huán)境影響；3.標(biāo)記數(shù)量多，遍及整個(gè)基因組；4.多態(tài)性高，自然存在許多等位變異；5.有許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，能鑒別純合基因型和雜合基因型，提供完整的遺傳信息；6.DNA分子標(biāo)記技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、易于自動(dòng)化；7.提取的DNA樣品在適宜條件下可長(zhǎng)期保存，這對(duì)于進(jìn)行追溯性或仲裁性鑒定是非常有利的。因此，DNA 指紋技術(shù)可應(yīng)用于動(dòng)、植以及微生物源性產(chǎn)品的真?zhèn)舞b定、摻假鑒定以及名特優(yōu)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源鑒定。

羅志勇等[8]采用AFLP指紋遺傳標(biāo)記技術(shù)分析了人參、西洋參、引種西洋參基因組多態(tài)性，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，成功構(gòu)建了多態(tài)性廣、重復(fù)性好的指紋圖譜，為人參、西洋參等的鑒定提供了依據(jù)；張銘等[9-11]采用RAPD指紋技術(shù)對(duì)15種鐵皮石斛、石斛屬的26個(gè)種和金石斛屬的1個(gè)種及13種石斛屬植物進(jìn)行鑒定，成功地將鐵皮石斛和金石斛屬等石斛屬植物區(qū)分開，為鑒別市售的偽劣鐵皮石斛提供了有效指紋鑒別圖譜；孫淑霞等[12]利用ISSR標(biāo)記對(duì)28份桃種進(jìn)行了品種鑒定及親緣關(guān)系檢測(cè)，獲得了相關(guān)指紋圖譜，篩選出9條特異DNA片段和11條特異缺失DNA片段，為有效地鑒別桃的品種、桃種質(zhì)資源研究和新品種保護(hù)提供理論基礎(chǔ)；楊文毅等[13]利用48個(gè)SSR分子標(biāo)記對(duì)來自9個(gè)不同國(guó)家的90個(gè)水稻品種進(jìn)行了遺傳相似性分析，結(jié)果共檢測(cè)到269個(gè)等位基因，90個(gè)品種在相似系數(shù)0.12 處，分為秈、粳2個(gè)亞種類群，在聚類樹形圖上可以有效地追溯到各品種的地理來源。

盡管DNA指紋技術(shù)在生物源性食品中具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，然而當(dāng)前國(guó)內(nèi)外未曾見到有采用該技術(shù)對(duì)燕窩及其制品的檢測(cè)鑒定的研究報(bào)道。這可能是因?yàn)檠喔C及其制品在形成商品前，經(jīng)過了一定程度的加工。而在加工過程中降解了部分DNA，富集到的DNA片段多為小分子量的DNA片段，因此不能建立具有特異性的DNA指紋圖譜。然而，在針對(duì)燕窩的摻假檢驗(yàn)與產(chǎn)地溯源檢驗(yàn)中，可以聯(lián)合應(yīng)用DNA 指紋技術(shù)應(yīng)與理化檢測(cè)技術(shù)，為更準(zhǔn)確地鑒別假冒偽劣食品和溯源優(yōu)良品種原材料產(chǎn)地提供技術(shù)支持。

3 基因芯片技術(shù)

基因芯片又稱DNA芯片（DNA chip）或DNA微陣列（DNA microarray），20世紀(jì)80年代末，基因芯片技術(shù)迅速發(fā)展，并成為生命科學(xué)領(lǐng)域一項(xiàng)高新技術(shù)，是一項(xiàng)基于基因表達(dá)和基因功能研究的革命性技術(shù)。基因芯片運(yùn)用DNA分子作為探針的生物芯片，在一個(gè)微小的載體表面點(diǎn)陣式排布大量的可尋址的探針分子，通過目標(biāo)基因與探針之間的配對(duì)反應(yīng)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行分析，獲得的光信號(hào)、電信號(hào)或磁信號(hào)被檢測(cè)儀器記錄并轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)，然后由計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)分析、解讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

基因芯片技術(shù)在一次實(shí)驗(yàn)中就可以對(duì)成千上萬的靶標(biāo)基因進(jìn)行測(cè)定，鑒于高通量的技術(shù)特點(diǎn)，可以運(yùn)用于復(fù)雜成分的篩查。目前基因芯片正在成為食品和食品原料檢測(cè)中一種較新的方法，檢測(cè)食品的營(yíng)養(yǎng)成分，監(jiān)督食品的衛(wèi)生、安全和食品質(zhì)量，保證人類健康，并且將對(duì)整個(gè)食品領(lǐng)域產(chǎn)生深刻的影響。Borucki等[14]成功構(gòu)建了一種可準(zhǔn)確鑒別24種近緣單核增多李斯特菌微陣列基因組芯片；Lee等[15]建立了一種基因芯片檢測(cè)技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)7種奶牛乳房炎常見病原微生物（金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌、牛棒狀桿菌、牛支原體、牛鏈球菌、停乳鏈球菌和無乳鏈球菌），該基因芯片能在6h內(nèi)完成整個(gè)檢測(cè)過程，且靈敏度高，目前已成功應(yīng)用于臨床；成曉維等[16]選取9種常見轉(zhuǎn)基因食品外源基因，制備一種可視芯片，可以一次檢測(cè)出5種的常見轉(zhuǎn)基因植物（轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻、油菜、小麥），該方法靈敏度可達(dá)0.1%，同時(shí)擺脫了基因芯片在雜交結(jié)果分析階段對(duì)熒光掃描儀的依賴，雜交結(jié)果明顯直觀；Kellya[17]等制備了一種基因檢測(cè)芯片，與從工業(yè)廢水處理廠收集樣品提取并通過羥自由基的方法標(biāo)記核酸的rRNAs，進(jìn)行雜交，證明了硝化細(xì)菌可以借助不需要PCR擴(kuò)增的芯片雜交來直接檢測(cè)到。

然而，基因芯片檢測(cè)技術(shù)需要大量已測(cè)知且準(zhǔn)確的遺傳信息作為基礎(chǔ)，所涉及使用的儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，同時(shí)對(duì)操作人員的專業(yè)素質(zhì)要求較高。因此，使用基因芯片技術(shù)檢測(cè)燕窩的研究報(bào)道鮮有報(bào)道。

當(dāng)前，人類已經(jīng)進(jìn)入大通量、大規(guī)模、大范圍的基因研究階段[18]，作為一項(xiàng)高新技術(shù)，基因芯片技術(shù)具有十分誘人的前景，但要運(yùn)用到食品安全檢測(cè)中還需解決以下問題：1.芯片制作工藝復(fù)雜，信號(hào)檢測(cè)需要專門的儀器設(shè)備，價(jià)格昂貴；2.樣品制備和標(biāo)記比較復(fù)雜，沒有一個(gè)統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)；3.實(shí)驗(yàn)室不能共享數(shù)據(jù)和資料庫(kù)等。這些都在一定程度上限制了基因芯片技術(shù)的運(yùn)用。為使基因芯片成為實(shí)驗(yàn)室研究或?qū)嵺`中可以普遍采用的技術(shù)，須從以下幾方面著手解決問題：1.提高基因芯片的特異性、重復(fù)性；2.簡(jiǎn)化樣品制備和標(biāo)記操作；3.增加信號(hào)檢測(cè)的靈敏度；4.研制和開發(fā)高度集成化的樣品制備、基因擴(kuò)增、核酸標(biāo)記及檢測(cè)儀器。

基因芯片技術(shù)盡管存在一定的不足和局限，但

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10.3969/j.issn.1007-550X.2017.05.007

TS207.3

A

1007-550X（2017）05-0047-04

2017-03-03

林釗（1989- ），男，福州永泰人，助理工程師，研究方向：微生物學(xué)。