糖尿病大鼠表皮組織表皮干細胞的β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6表達變化

李亞蓉，毛紅，趙湜，周玲

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院，武漢430014)

糖尿病大鼠表皮組織表皮干細胞的β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6表達變化

李亞蓉，毛紅，趙湜，周玲

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院，武漢430014)

目的觀察糖尿病(DM)大鼠表皮組織表皮干細胞(ESCs)中β-連環素(β-catenin)、周期蛋白D1(Cyclin D1)、Wnt通路蛋白1(Wnt-1)、細胞角蛋白K6表達變化，探討DM大鼠ESCs結構和功能變化的機制。方法將30只大鼠隨機分為觀察組和對照組，各15例。觀察組用鏈脲佐菌素法制作DM模型，對照組常規飼養。造模成功28 d后取兩組大鼠表皮組織，分離ESCs，采用免疫組化SP法測算兩組ESCs的β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性表達率和β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性染色積分光密度值(IA)。結果觀察組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性表達率分別為15.07%、16.89%、15.51%、14.67%，對照組分別為72.04%、68.91%、65.08%、57.13%，兩組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性表達率相比P均<0.05。觀察組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性染色IA分別為74.41±6.17、68.25±5.79、31.67±6.09、60.54±26.72，對照組分別為117.34±10.05、109.45±7.67、72.42±7.98、125.54±30.14，兩組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性染色IA相比P均<0.05。結論DM大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、CyclinD1、Wnt-1、K6表達降低，這可能是DM大鼠ESCs結構和功能變化的機制。

糖尿病；表皮干細胞；β-連環素；周期蛋白D1；Wnt通路蛋白1；細胞角蛋白；動物實驗

糖尿病(DM)患者的皮膚創傷面具有難愈合或不愈合的特點，治療棘手[1]。表皮干細胞(ESCs)具有生成新皮膚及附屬組織、修復創傷口、促進表皮良性異化的功能，是皮膚創傷愈合過程中的重要細胞[2，3]。DM患者表皮組織中ESCs結構發生變化，導致其功能降低，但其機制并不明確[4]。β-catenin是一種調節表皮ESCs分化的重要細胞因子，周期蛋白D1(Cyclin D1)、Wnt通路蛋白1(Wnt-1)、細胞角蛋白K6是其下游靶基因表達的蛋白[5]。DM大鼠表皮組織ESCs結構和功能的變化可能與β-catenin及其下游cyc1inD1、Wnt-1、K6表達變化有關。本研究觀察了DM大鼠ESCs中β-catenin、cyc1inD1、Wnt-1、K6表達變化，探討DM大鼠ESCs結構和功能變化的機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器 30只實驗SD雄性大鼠購自長沙市天勤生物技術有限公司，體質量300～360 g，實驗前均于培養室內喂養7 d，飼養環境溫度20～26 ℃，相對濕度50～60%。鏈脲佐菌素購自上海士鋒生物科技有限公司，β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1抗體試劑均購自美國圣克魯斯生物技術公司，K6抗體購自上海拜力生物科技有限公司，免疫組織化學SP檢測試劑盒購自北京中杉金橋公司，免疫組織化學試劑盒、DAB試劑盒、PBS、檸檬酸鈉溶液均購自上海金標公司，K-SFM培養基、胎牛血清素購自英國Gibco公司，Ⅳ型膠原購自美國Sigma公司，免疫定量ELISA分析試劑盒購自美國R&D公司。BHC-1300IIA2超凈無菌工作臺購自蘇州蘇潔凈化設備公司，GTR16-2高速離心機購自北京時代北利離心機有限公司，DM1000顯微鏡購自德國徠卡公司，奧林巴斯CX31數碼圖像系統購自日本奧林巴斯公司，KD-202A石蠟切片機購自西安金馬醫療器械有限公司，穩步血糖測定儀購自美國強生公司。

1.2 大鼠分組及DM模型建立方法 將30只大鼠隨機分為分為觀察組及對照組，每組15只。觀察組大鼠采用鏈脲佐菌素建立DM模型，具體方法如下[6]：大鼠腹部注射55～60 mg/kg鏈脲佐菌素溶液，正常喂食、喂水2 d后每日測血糖，連續3次血糖高于6.8 mmol/L且大鼠現飲食、飲水、排尿多但體型消瘦判定為造模成功。觀察組均造模成功，然后繼續飼養28 d。對照組大鼠常規飼養。

1.3 表皮組織ESCs分離方法 在無菌環境下用手術刀切取兩組大鼠尾背部表皮，無菌碘液棉簽擦凈所取標本，生理鹽水沖洗10 min，放置在超凈工作臺上[9]，手術刀逐次清除多余結締及皮下組織；放入無菌培養皿，分別青霉素G溶液1次×3 min、D-Hank′s溶液2次×3 min漂洗。切表皮標本約為0.5 cm×0.5 cm碎塊，放入培養瓶內，加入5 mL的0.25～0.3%胰蛋白酶+EDTA溶液，放入4 ℃冰箱培養12 h。取出放入培養皿內，滴加約2 mL PBS，再次D-Hank′s 溶液2次漂洗3 min，后將標本表皮層剝離粉碎，放入無菌培養瓶內，再次D-Hank′s溶液吹打5～7次，標本混合篩網過濾，清液進入離心管，1 200 r/min離心5min。棄上清后作細胞懸液并計數細胞，將懸液滴入培養板于37 ℃、5%CO2、100%濕度中培養20 min，去培養液及未勃附細胞，滴入有ESCs培養液的培養皿，于37 ℃、5%CO2、100%濕度中培養，換液1次/3 d，直到約70%～80%ESCs細胞1∶3融合傳代，棄培養液，PBS洗3次，滴0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液調細胞溶液為懸浮狀態，30 s內滴入10% 胎牛清血素，1 200 r/min離心5 min，去分離上層液，滴入K-SFM培養基，吹打、重懸后接種于培養瓶，去未貼壁細胞。

1.4 ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6檢測方法 采用免疫組化SP法。兩組ESCs培養24 h后，取細胞密度1×105/mL培養液滴入玻片，PBS浸3次，每次 3 min，90%乙醇固定20 min，PBS浸3次，每次3 min，加0.5% 曲拉通X-100孵育15min，PBS浸3 次× 3 min/次，滴40 mL 3%H2O2阻斷液，25 ℃條件下孵育10 min，PBS洗滌3 次× 3 min/次，滴50 μL一抗覆蓋切片，入37 ℃水浴箱育30 min，PBS洗3次×3 min/次，滴二抗，PBS洗3次，2 min/次，DAB顯色及蘇木素復染，乙醇脫水干燥切片。Ⅳ型樹膠封固。倒置相差顯微鏡下觀察(400×)，β-catenin陽性染色為細胞膜上棕黃色顆粒，cyclinD1陽性染色為細胞核棕黃色顆粒，K6和Wnt-1陽性染色為細胞質棕黃色顆粒。隨機選取3個視野，每個視野計數1 000個細胞，計算β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性表達率。對染色切片進行拍照，用奧林巴斯CX31數碼圖像分析系統測算β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性染色積分光密度值(IA)。

2 結果

觀察組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性表達率分別為15.07%、16.89%、15.51%、14.67%，對照組分別為72.04%、68.91%、65.08%、57.13%，兩組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性表達率相比P均<0.05。觀察組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性染色IA分別為74.41±6.17、68.25±5.79、31.67±6.09、60.54±26.72，對照組分別為117.34±10.05、109.45±7.67、72.42±7.98、125.54±30.14，兩組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽性染色IA相比P均<0.05。

3 討論

目前全球DM患者人數接近2.8億，我國DM患者人數處于全球第二位[13，14]，并呈現不斷增多的態勢，形勢較為嚴峻。DM患者并發潰瘍、創傷后創面難以愈合，致殘率極高，給患者身體及心理帶來極大痛苦[15，16]。DM患者皮膚創傷難以愈合的原因較為復雜。國內外眾多研究顯示，DM造成創傷難愈合的主要原因為：①DM會引起患者體內糖代謝功能障礙，造成體內糖基化物質濃度上升，破壞細胞膜結構，造成表皮細胞凋亡[17]；②DM患者多伴發神經性病變，導致機體促表皮愈合神經信號傳導受阻，造成人體正常對損傷自修復調節機制運轉滯后，干擾正常的組織及皮膚自然性愈合[18]；③DM可致患者生長因子受體異變及濃度下降，阻礙表皮細胞及皮下組織、肌肉組織細胞DNA合成[19]，干擾正常構成新人體組織細胞的增殖，減慢新組織添補創傷口[20]；④多數DM患者因病變及營養物質攝入量不足，自身免疫功能下降，故對侵入細菌抵抗力不足，可致創傷口感染，促使傷口膿化，進一步干擾表皮細胞更新增殖；⑤DM患者血運能力下降，造成表皮創傷口血液流量降低，造成創傷壞死。針對這些原因，有研究提出在促DM患者創傷愈合過程中，利用人體自然促表皮細胞增殖因子使得創面上皮化功能正常發揮，提高愈合效果，同時已有研究證明[21]，DM大鼠表皮組織ESCs數量少、活性低。因此，我們認為ESCs結構變化導致的功能下降可能是導致DM患者創面難愈的一個重要因素。

有研究顯示[22]，β-catenin是一種調節表皮ESCs分化的重要因子，促進機體對創傷進行自然性修復，其通過和上表皮組織內ESCs內鈣黏蛋白結合[23]，促進細胞間黏合及和外基質鏈接，保證表皮結構完整性，激活Wnt通路[24]，而Wnt-1和表皮組織生成、生長及愈合具有密切關系[25]。同時，β-catenin還可激活其下游靶基因CyclinD1，提高其表達水平，其可加快表皮細胞生長周期進階速度，細胞增殖及分化關系較密切，加快表皮自修復進程。K6蛋白作為一種人體內促細胞增殖的角蛋白，其和細胞增殖關系較密切，有研究認為K6濃度水平與表皮細胞過度增殖具有顯著的正相關性。本研究結果顯示，觀察組DM大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、CyclinD1、Wnt-1、K6陽性表達率和陽性染色IA均低于對照組，說明DM大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、CyclinD1、Wnt-1、K6表達降低。筆者推測這可能是導致DM大鼠表皮組織ESCs功能下降的原因。

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2016-12-20)