知柏地黃丸對陰虛“上火”證血清抗炎凝血蛋白的影響

毛連根 劉昌銘 楊 粟 江婷婷 陳鐘梁 屠慧惠 陳 靜 胡玉婷 甘 霖 李仲杰 李繼承，

(1 浙江大學細胞生物學研究所，杭州，310058； 2 華南理工大學醫(yī)學院，廣州，510006)

知柏地黃丸對陰虛“上火”證血清抗炎凝血蛋白的影響

毛連根1劉昌銘1楊 粟1江婷婷2陳鐘梁1屠慧惠1陳 靜1胡玉婷2甘 霖2李仲杰1李繼承1，2

(1 浙江大學細胞生物學研究所，杭州，310058； 2 華南理工大學醫(yī)學院，廣州，510006)

目的：探究知柏地黃丸(Zhibai Dihuang Granule；ZDG)對陰虛“上火”證血清抗炎凝血蛋白的影響。方法：通過腹腔注射三碘甲狀腺原氨酸(Triiodothyronine；T3)處理SD大鼠建立陰虛模型。在該模型基礎(chǔ)上往大鼠牙齦出滴加牙齦卟啉單胞菌疊加口腔牙齦炎模型，建立陰虛“上火”證大鼠模型。用滋陰降火藥知柏地黃丸對大鼠進行治療，以iTRAQ-2DLC-MS/MS蛋白組學技術(shù)與生物信息學手段分析治療前后陰虛“上火”大鼠血清差異性蛋白表達譜，探索知柏地黃丸治療陰虛“上火”的生物學機制。結(jié)果：知柏地黃丸觀察組大鼠血清凝溶膠蛋白(Gsn)、纖溶酶原(Plg)、纖維蛋白原α鏈(Fga)、胸腺素β4(Tmsb4x)比值顯著上調(diào)(Fold Change>1.25)；膠原蛋白α2-I型鏈(Col1a2)比值顯著下調(diào)(Fold Change<0.8)。Gsn是機動蛋白絲的切割蛋白，參與細胞凋亡、清除損傷組織、調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)等生物學功能；Plg是血液纖維蛋白水解酶無活性的前體，參與機體纖溶、細胞遷移、細胞外基質(zhì)降解等多種生物過程；Fga是由肝臟合成的纖維蛋白前體，能在內(nèi)源凝血因子或外源組織因子作用下生成纖維蛋白，參與機體的凝血過程；Colla2是由肝、巨核細胞合成的凝血蛋白酶，是活化Fga的凝血穩(wěn)定因子，F(xiàn)ga在Colla2的作用下參與完成凝血過程；T-β4是由胸腺產(chǎn)生的淋巴生長因子，具有通過抑制巨噬細胞的遷移、增強抗原提呈細胞功能、抑制炎性因子、促進組織重塑、血管生成和傷口愈合修復等生物學功能。結(jié)論：知柏地黃丸通過對Gsn、Plg、Fga、Colla2、T-β4水平的調(diào)節(jié)，清除損傷組織，釋放肌動蛋白、細菌脂多糖，抑制細胞凋亡作用；并且可以調(diào)節(jié)炎性因子，改變炎性反應(yīng)部位血液流變動力學障礙，促進炎性反應(yīng)損傷的愈合的作用。

知柏地黃丸；陰虛“上火”；蛋白組學；抗炎；凝血；發(fā)病機制

中醫(yī)認為情志是機體的精神狀態(tài)，是人對客觀外界事物和現(xiàn)象所做出的7種不同情緒反映[1]。情志與臟腑的功能活動密切相關(guān)，情志過激可致相火妄動，相火妄動是導致疾病的因素之一[2-3]。以腹腔注射三碘甲狀腺原氨酸(Triiodothyronine；T3)處理SD大鼠建立陰虛模型[4]，并在模型基礎(chǔ)上疊加口腔牙齦炎模型，建立陰虛“上火”證(Yin-deficiency-Shanghuo Syndrome，YDS)大鼠模型；以iTRAQ-2DLC-MS/MS蛋白組篩選鑒定技術(shù)與生物學信息手段探究知柏地黃丸對YDS大鼠血清抗炎凝血生物物質(zhì)的變化，為探究闡明知柏地黃丸滋陰降火治療機制與陰虛“上火”證病機提供現(xiàn)代生物學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取SPF級雌性SD大鼠30只(浙江省醫(yī)科院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可批準文號：SCXK(浙)2014-0001)。

1.1.2 藥物 三碘甲狀腺原氨酸(Triiodothyronine；T3，北京百靈威科技有限公司，生產(chǎn)批號：L840O63)；牙髓卟啉單胞菌冷凍干菌粉(廣東省微生物菌種保藏中心，生產(chǎn)批號：201505)；戊巴比妥鈉(中國醫(yī)藥上海化學試劑公司(進口分裝)，生產(chǎn)批號：020402)；知柏地黃丸(ZhibaiDihuangGranule；ZDG，仲景宛西制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：161204)。

1.1.3 試劑與儀器 iTRAQ試劑盒(Applied Biosystems，F(xiàn)oster city，CA,USA)；LCMS-8030、Triple Quadrupole MS/MS(日本島津制作所)；超低溫冰箱THERMO(902-ULTS)；離心機(SIGMA,2K15C)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 取5～6周齡，體重220～240 g SPF級雌性SD大鼠30只。稱重，隨機分成YDH模型組(簡稱：模型組)、生理鹽水對照組(簡稱：對照組)、知柏地黃丸觀察組(簡稱：觀察組)3組，每組10只。第2天開始，模型組、觀察組每天下午4點腹腔注射T3(2.5 mg%，0.2 mL/100(g·d))、對照組腹腔注射0.9%生理鹽水(0.2 mL/100(g·d))，連續(xù)造模6 d。此間，模型組、觀察組大鼠，于腹腔注射T3第4天以2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉，用絲線結(jié)扎下門齒，剝離部分牙齦，滴注PBS(pH7.2)稀釋至近似3×108/mL的牙髓卟啉單胞菌液，200 μL/(次·d)，共4次進行牙齦炎造模。對照組大鼠不進行牙齦炎造模。第7天起，觀察組灌胃知柏地黃丸中藥(0.8 g/1 mL，1 mL/100(g·d)、模型組與對照組灌胃(0.9%生理鹽水，1 mL/100(g·d)。連續(xù)給藥治療7 d。給藥治療第8天，觀察組于給藥后2 h(對照組、模型組于給生理鹽水后2 h)以2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉，進行頸中動脈插管手術(shù)取血采樣。將血分別置于無肝素試管，室溫靜置2 h，3 000 r/min，離心10 min，提取血清，置-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 iTRAQ-2DLC-MS/MS血清差異蛋白篩選鑒定分析 血清高豐度蛋白去除：用4.6×100 mm多親和處理系統(tǒng)(MARS)LC Column-Human 14結(jié)合HPLC系統(tǒng)處理血清樣品，除去14種高豐度蛋白(血清白蛋白、免疫球蛋白G，抗胰蛋白酶，IgA，IgM等)。iTRAQ試劑標記：每組取等量血清樣本，先用預(yù)冷的丙酮處理，12 000 r/min離心15 min后棄去上清后，用試劑盒中自帶的溶解液和1% SDS充分混懸溶解樣品；還原試劑于60 ℃反應(yīng)1 h；半胱氨酸封閉試劑于室溫處理10 min；胰蛋白酶于37 ℃酶解過夜，使蛋白質(zhì)酶解。在118、119、121各管標記試劑中加入50 μL異丙醇，混勻，分別加入各組樣品中于室溫反應(yīng)1 h，各加入3倍體積水，使標記試劑分解。最后合并各管標記好的樣品，真空冷凍干燥處理。第一維SCX分離肽段：將iTRAQ試劑標記的樣品混合物加入強陽離子交換(SCX)柱中多次洗脫。根據(jù)峰型和時間共收取10個梯度，真空離心濃縮后，用反相液相色譜的A相溶解。第二維反相液相色譜：用ZORBAX 300SB-C18column處理，用不同濃度的乙腈和甲酸的洗脫液洗脫。LC-MS/MS分析：將2DLC分離獲得的蛋白質(zhì)直接進行后續(xù)質(zhì)譜掃描分析。在QSTAR XL在IDA模式下操作，在m/z 400-1 500范圍內(nèi)進行MS分析，在一個圖譜選擇20個最強的母離子進行串級掃描，掃描范圍m/z 100-2 000。獲得差異蛋白表達譜。

1.2.3 生物信息學分析 采用Protein Pilot 4.2 beta軟件分析數(shù)據(jù)，檢索International Protein Index(IPI)數(shù)據(jù)庫，并對其定量。使用DAV ID(http://david.abcc.ncifcrf.gov)方法對蛋白質(zhì)注釋和分類。蛋白之間的互作關(guān)系應(yīng)用STRING軟件完成(http://string.embl.de/)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，采用t檢驗分析，非參數(shù)分析用Mann-Whitney U-test檢測，組間差異比較采用單因素方差分析。差異蛋白比倍率>1.25或<0.8認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 知柏地黃丸治療陰虛大鼠“上火”血清差異性蛋白篩選鑒定分析結(jié)果 觀察組血清凝溶膠蛋白(Gsn)、纖溶酶原(Plg)、纖維蛋白原α鏈(Fga)、胸腺素β4(Tmsb4x)比值顯著上調(diào)(Fold change>1.25)；膠原蛋白α2-I型鏈(Col1a2)比值顯著下調(diào)(Fold change<0.8)。見表1。

注：差異蛋白比倍率>1.25或<0.8認為差異有統(tǒng)計學意義

3 討論

陰虛“上火”是現(xiàn)代社會多發(fā)頻發(fā)病證，誘因復雜。現(xiàn)代醫(yī)學對陰虛“上火”缺乏有效的治療方法，但中醫(yī)對陰虛“上火”的認識已歷史悠久，《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》[5]，《景岳全書》[6]等許多中醫(yī)經(jīng)典對“上火”證病機與治療早有詳細記載。陰虛“上火”系人體陰陽失衡內(nèi)熱亢盛，“相火妄動”所致，對于該證以滋陰降火為治療原則。陰虛“上火”證主要表證為反復發(fā)作的口腔潰瘍、牙齦腫痛炎、鼻扭、慢性咽喉炎等與皮膚黏膜關(guān)聯(lián)密切的炎性反應(yīng)，而炎性反應(yīng)是機體血管生物物質(zhì)對于機體損傷的防御反應(yīng)，炎性反應(yīng)發(fā)生進程中的血管中的抗炎與凝血生物物質(zhì)對于防御反應(yīng)具有重要作用。以知柏地黃丸為工具探究陰虛“上火”證血管中的抗炎與凝血生物物質(zhì)的變化，對于闡明知柏地黃丸滋陰降火作用機制及陰虛“上火”證病機具有重要意義。

研究結(jié)果顯示，知柏地黃丸具有上調(diào)血清Gsn、Plg、Fga表達的作用。Plg是機動蛋白絲的切割蛋白，在CaCl2、pH、磷酸磷脂酰肌醇等作用下，能參與對肌動蛋白絲的剪切、聚合和解聚；也可以作為細胞凋亡過程中關(guān)鍵的執(zhí)行分子之一胱天蛋白酶的底物與二磷酸磷脂酰肌醇-3形成的復合體，降低二磷酸磷脂酰肌醇-3活性，進而抑制細胞凋亡過程[7]；Gsn還能與脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)競爭性結(jié)合脂多糖，抑制與肌動蛋白的結(jié)合活性和血清肌動蛋白的解聚活性；Gsn能在清除損傷組織細胞釋放的肌動蛋白同時，對炎性反應(yīng)遞質(zhì)進行調(diào)節(jié)[8-9]。血液中Gsn過表達有利于減輕炎性反應(yīng)與炎性反應(yīng)損傷的愈合[10]。知柏地黃丸對Gsn的上調(diào)作用提示知柏地黃丸具有清除損傷組織細胞釋放的肌動蛋白、降解脂多糖，減輕炎性反應(yīng)促進炎性反應(yīng)損傷愈合和抑制細胞凋亡的作用。

研究結(jié)果顯示，知柏地黃丸組還具有上調(diào)Plg、Fga下調(diào)Colla2的作用。Plg是血液纖維蛋白水解酶無活性的前體，其能在內(nèi)源性纖溶酶原激活物或外源激活物的作用下活化成纖溶酶，參與機體纖溶、細胞遷移、細胞外基質(zhì)降解等多種生物過程。知柏地黃丸上調(diào)Plg表達，提示知柏地黃丸具有提高纖溶酶生成基質(zhì)，促進纖溶酶生成量進而改變炎性反應(yīng)損傷組織部位血液流變動力學障礙，促進炎性反應(yīng)傷口愈合作用。Fga是由肝臟合成的纖維蛋白前體，能在內(nèi)源凝血因子或外源組織因子作用下生成纖維蛋白，參與機體的凝血過程。Colla2是由肝、巨核細胞合成的凝血蛋白酶，是活化Fga的凝血穩(wěn)定因子，F(xiàn)ga在Colla2的作用下參與完成凝血過程。知柏地黃丸上調(diào)血清Fga表達，但對Colla2顯著下調(diào)，這樣仍然影響凝血形成過程。這提示知柏地黃丸具有抗凝血形成的促進血液循環(huán)作用。

研究結(jié)果還顯示，知柏地黃丸具有上調(diào)T-β4表達作用。T-β4是由胸腺產(chǎn)生的淋巴生長因子，其具有通過抑制巨噬細胞的遷移，增強抗原提呈細胞功能，抑制炎性因子，降低炎性反應(yīng)細胞的浸潤，減輕炎性反應(yīng)與防止新生組織受到炎性反應(yīng)的損害的作用[11]；T-β4還具有促進組織重塑、血管生成和傷口愈合修復等功能[12]。知柏地黃丸上調(diào)T-β4表達的作用，這表明知柏地黃丸具抑制炎性因子，增強抗炎與炎性反應(yīng)傷口愈合修復能力的作用。

上述結(jié)果提示：知柏地黃丸通過對Gsn、Plg、Fga、Colla2、T-β4蛋白組的調(diào)節(jié)改變陰虛“上火”證炎性反應(yīng)損傷組織部位的血液流變動力學障礙，促進血液循環(huán)及抑制細胞凋亡，增強抗炎與炎性反應(yīng)傷口愈合修復能力。這結(jié)果也提示陰虛“上火”證炎性反應(yīng)反復發(fā)作與這些蛋白的調(diào)節(jié)改變密切關(guān)聯(lián)。

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EffectofZhibaiDihuangGranuleonAnti-inflammatoryandClottingSerumProteinsinYin-deficiencyShanghuoSyndrome

Mao Liangen1, Liu Changming1, Yang Su1, Jiang Tingting2, Chen Zhongliang1, Tu Huihui1, Chen Jing1, Hu Yuting2, Gan Lin2, Li Zhongjie1, Li Jicheng1, 2

(1InstituteofCellBiology,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China; 2SchoolofMedicine,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China)

Objective:To explore the influence of Zhibai Dihuang Granule (ZDG) on the anti-inflammatory clotting serum proteins in Yin-deficiency Shanghuo(YDS) syndrome. Yin-deficiency SD rats were induced by intraperitoneal injection of Triiodothyronine (T3). The models of gingivitis in rats were induced by dropwise add of porphyromonas gingivalis model. YDS syndrome rats were treated with ZDG for 1 week. iTRAQ-2DLC-MS/MS was used in screening and identifying the serum differential proteins. With the treatment of ZDG, the serum level of Gelsolin (Gsn), Plasminogen (Plg), Fibnnogenalpha chain (Fga), and Thymus beta-4 (T-β4) were significantly increased (fold change>1.25), while the serum level of Collagulation factor XIII Achain and Colla2 were significantly decreased (fold change<0.8). Gsn possesses the function of removing damaged tissue, releasing the actin, inhibiting the apoptosis of the cells, and inhibiting the apoptosis of the cells. Colla2 and Plgcan regulated the change of blood rheology in the inflammatory site. Gsn and T-beta 4 presented the ability in regulating inflammatory cytokines to promote the healing of inflammatory damage.ConclusionZDG may play an important role in clearing actin and lipopolysaccharide released by damage tissue and inhibiting the cell apoptosis. Besides, ZDG may regulate inflammatory factors, change the blood rheology of the inflammatory site, promot the healing of inflammatory damage. In short, ZDG treats YDH syndrome by regulating these proteins associated with anti-inflammatory and clotting.

Zhibai Dihuang Granule; Yin-deficiency Shanghuo syndrome; Proteomics; Anti-inflammatory; Clotting; Pathogenesis

R285.6

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.006

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(2014CB543002)

毛連根(1957.06—)，男，碩士，實驗師，研究方向：藥理學，E-mail：zdmlg301@126.com

李繼承(1957.12—)，男，碩士，教授，浙江大學細胞生物學研究所所長，研究方向：肺結(jié)核生物學標志物及其中醫(yī)證候的生物學研究，E-mail：lijichen@zju.edu.cn

(2017-11-03收稿 責任編輯：張文婷)