黑木耳菌種區(qū)別性鑒定的對峙培養(yǎng)法及其應(yīng)用

姚方杰 于 婭 方 明 王 鵬 魯麗鑫 張友民* 張偉彤 姚允武

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黑木耳菌種區(qū)別性鑒定的對峙培養(yǎng)法及其應(yīng)用

姚方杰1于 婭1方 明1王 鵬1魯麗鑫1張友民1*張偉彤1姚允武2

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，吉林長春 130118；2. 吉林省海外農(nóng)業(yè)投資開發(fā)集團(tuán)有限公司，吉林長春 130000）

著重介紹黑木耳菌種區(qū)別性（供檢菌種和對照菌種的不符合性）鑒定的對峙培養(yǎng)法及其術(shù)語、定義和原理，試劑、材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法，以及效果。

黑木耳；菌種；區(qū)別性；鑒定；對峙培養(yǎng)法

黑木耳（）具有獨(dú)特生態(tài)、保健功能和極高比較效益（為水稻和玉米的10～15倍）。21世紀(jì)以來，以創(chuàng)新的“全光間歇彌霧栽培模式”為產(chǎn)業(yè)化載體，使黑木耳實(shí)現(xiàn)了“北耳南擴(kuò)”的產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略[1]，產(chǎn)業(yè)規(guī)模迅速上升為我國第二大類食用菌。2014年我國年產(chǎn)黑木耳579萬噸，占食用菌總產(chǎn)量的17.71%。伴隨著黑木耳產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，菌種使用量急劇增加，黑木耳菌種市場混亂，出現(xiàn)惡意侵權(quán)、同物異名、同名異物等現(xiàn)象，給引種、栽培和開發(fā)利用帶來諸多困難，導(dǎo)致產(chǎn)量低下，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，危及黑木耳產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2,3]。

科學(xué)的菌種鑒定是食用菌品種審定和生產(chǎn)應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)，涉及知識面廣、技術(shù)性強(qiáng)，受到國際上的高度重視。然而，我國從國家層面到各地方，尚未建立科學(xué)有效的黑木耳菌種鑒定方法。雖曾發(fā)布實(shí)施通用的食用菌菌種區(qū)別性及真實(shí)性鑒定方法，但經(jīng)本項(xiàng)目組及同行們的研究，發(fā)現(xiàn)其主要參數(shù)不符合黑木耳菌種特性。因此，作者所在團(tuán)隊(duì)根據(jù)對100余個黑木耳菌株的試驗(yàn)及查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，采用體細(xì)胞不親和性等方法，從細(xì)胞學(xué)水平、生化水平和DNA水平對黑木耳菌種進(jìn)行區(qū)別性鑒定，以期為《全國食用菌菌種管理辦法》的貫徹執(zhí)行，防止菌種混雜退化，充分發(fā)揮優(yōu)良菌種種性，以及保護(hù)菌種知識產(chǎn)權(quán)提供規(guī)范的方法與技術(shù)支持，推動我國食用菌菌種可追溯制度的建立與實(shí)施，促進(jìn)黑木耳乃至所有食用菌產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

菌種區(qū)別性是指供檢菌種與對照菌種的不符合性，對峙培養(yǎng)法是檢測食用菌菌種區(qū)別性的科學(xué)實(shí)用方法。該方法引用食用菌菌種區(qū)別性鑒定-拮抗反應(yīng)（NY/T 1845）標(biāo)準(zhǔn)，適用于黑木耳菌種區(qū)別性鑒定。

1 術(shù)語和定義

NY/T 1845界定的，以及下列術(shù)語和定義適用于本文。為了便于使用，以下重復(fù)列出了NY/T 1845中的某些術(shù)語和定義。

（1）黑木耳（）。木耳科，子實(shí)體膠質(zhì)，朵型分為菊花型或簇生型，耳片黑色、褐色、灰色，子實(shí)層光滑或有褶皺。（2）菌種區(qū)別性（distinctness of spawn）。供檢菌種和對照菌種的不符合性[4]。（3）隆起型（ridgy）。對峙培養(yǎng)的黑木耳菌株間拮抗表現(xiàn)特征之一，表現(xiàn)為兩菌株菌落交界處菌絲隆起[4]。（4）溝壑型（chimb）。對峙培養(yǎng)的黑木耳菌株間拮抗表現(xiàn)特征之一，表現(xiàn)為兩菌株菌絲在交界處分別密集或稍微隆起，兩隆起之間出現(xiàn)一條溝壑狀分隔線。（5）色線型（color bar）。對峙培養(yǎng)的黑木耳菌株間拮抗表現(xiàn)特征之一，表現(xiàn)為兩菌株菌落交界處形成一條色素分界線。（6）隔離型（dividing line）。對峙培養(yǎng)的黑木耳菌株間拮抗表現(xiàn)特征之一，表現(xiàn)為兩菌株菌落交界處出現(xiàn)一條無菌絲的帶狀分隔區(qū)。

2 原 理

兩個不同的菌株對峙培養(yǎng)時發(fā)生拮抗反應(yīng)，是黑木耳菌株識別異己保持群體遺傳多樣性的反映。它是由基因組內(nèi)異核體不親和位點(diǎn)控制的。當(dāng)不親和的兩個菌株對峙培養(yǎng)時，在菌株交界處形成隆起、溝壑、色線或隔離，產(chǎn)生拮抗，防止遺傳上明顯不同的個體間菌絲融合，以保持個體遺傳上的獨(dú)立和穩(wěn)定。

3 試劑、材料和儀器設(shè)備

培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），其中馬鈴薯200 g（用浸出汁），葡萄糖20 g，瓊脂20 g，去離子水或相當(dāng)純度的水1000 mL，pH?值自然。生化恒溫培養(yǎng)箱：精度±0.1 ℃。分析天平：感量0.01 g。

4 試驗(yàn)步驟

供檢黑木耳菌株與對照菌株在相同條件下培養(yǎng)，將固體菌種從試管斜面接種到直徑?90 mm的固體PDA平板上，25 ℃?避光培養(yǎng)?15天。

（1）接種組合與重復(fù)次數(shù)。黑木耳供檢菌株與對照菌株的拮抗反應(yīng)接種組合為?3?組，每組重復(fù)?3?次。第一組：供檢菌株與對照菌株對峙培養(yǎng)；第二組：供檢菌株與供檢菌株對峙培養(yǎng)；第三組：對照菌株與對照菌株對峙培養(yǎng)。

（2）接種操作。嚴(yán)格按無菌操作，用直徑?5 mm?打孔器分別打取活化后適齡的黑木耳供檢菌株與對照菌株菌落邊緣做接種塊。菌絲朝上，兩接種塊間隔?30 mm，置于平板中心位置。

（3）培養(yǎng)條件。在通風(fēng)、避光、溫度為?25 ℃?條件下培養(yǎng)至接種塊菌絲間接觸，約需?20?～25天。

（4）數(shù)據(jù)處理。在自然光下，觀察對峙培養(yǎng)的兩株菌落交界處菌絲，有隆起型、溝壑型、色線型、隔離型四者之一的拮抗反應(yīng)，判定為不同菌株[5]。

5 討 論

我國是黑木耳生產(chǎn)和消費(fèi)大國，占世界產(chǎn)量的98%以上[6]。世界上其他國家沒對黑木耳此類的專項(xiàng)研究，因此也就沒有相對有效的方法可以借鑒或者直接利用。國內(nèi)迄今也尚無黑木耳菌種區(qū)別性鑒定的相關(guān)方法的報(bào)道。

目前，對于黑木耳菌種的區(qū)別性鑒定主要采用對峙培養(yǎng)法、RAMP法和ITS PCR-RFLP法。其中，賈定洪于2010年采用ITSPCR-RFLP方法對5個野生木耳屬菌株進(jìn)行分析，通過6個限制性內(nèi)切酶消化獲得了20條多態(tài)性DNA條帶，使用NTSYSpc2.1生物軟件對DNA條帶信息進(jìn)行分析，結(jié)果表明，ITSPCR-RFLP技術(shù)可為區(qū)別黑木耳和毛木耳菌株提供重要信息[7,8]。湯海峰利用RAMP法標(biāo)記鑒定在吉林省黑木耳生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的品種，對22個黑木耳品種比較分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其中存在同種異名現(xiàn)象[9,10]。但是上述兩種方法操作起來相比對峙培養(yǎng)法要復(fù)雜，標(biāo)記過程會耗費(fèi)大量的時間和精力，并且對操作技術(shù)的要求很高，不適合普遍推廣。而采用對峙培養(yǎng)法進(jìn)行黑木耳區(qū)別性鑒定，操作方便、成本低，且鑒定結(jié)果易于觀察，更適合推廣使用。如陳影等和方明等在進(jìn)行木耳的新品種選育過程中運(yùn)用對峙培養(yǎng)法對黑木耳進(jìn)行區(qū)別性鑒定，通過觀察菌落交界處的拮抗反應(yīng)進(jìn)行前期試驗(yàn)，從而簡化了試驗(yàn)步驟[11, 12]。孫露在2010年研究黑木耳種質(zhì)資源多樣性時也采用對峙培養(yǎng)法對黑木耳菌種進(jìn)行區(qū)別性鑒定[13]。

[1] 姚方杰. “北耳南擴(kuò)”的喜與憂[J]. 中國食用菌, 2012, 01: 61-62.

[2] 姚方杰, 張友民, 陳影. 我國黑木耳產(chǎn)業(yè)發(fā)展形勢[J]. 北方園藝, 2010 (18): 209-211.

[3] 姚方杰, 張友民, 王曉娥, 等. 黑木耳菌種質(zhì)量可追溯規(guī)范“表格式明白紙”[J]. 食藥用菌, 2012, 04: 202-203.

[4] 食用菌菌種區(qū)別性鑒定拮抗反應(yīng)[S]. NY/T 1845—2010.

[5] 陳影. 黑木耳栽培種質(zhì)資源多樣性的研究及核心種質(zhì)群的建立[D]. 長春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[6] 姚方杰, 張友民, 魯麗鑫, 等. 黑木耳遺傳育種研究進(jìn)展[J]. 菌物研究, 2015(03): 125-128, 122.

[7] 賈定洪, 鄭林用, 郭勇, 等. 5個野生木耳屬菌株的ITS PCR-RFLP分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2010(02): 449-453.

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[9] 湯海峰. RAMP在黑木耳品種鑒定中的應(yīng)用研究[D]. 吉林: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[10] 尚海英, 鄭有良, 魏育明, 等. 應(yīng)用ISSR標(biāo)記研究黑麥屬植物遺傳多樣性[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2004 (03): 273-277.

[11] 陳影, 姚方杰, 張友民, 等. 黑木耳新品種選育研究[J]. 北方園藝, 2014 (08): 133-134.

[12] 方明, 姚方杰, 王曉娥, 等. 木耳新品種選育研究[J]. 菌物研究, 2012 (04): 263-265.

[13] 孫露. 木耳屬種質(zhì)資源多樣性研究簡報(bào)[A]. 中國菌物學(xué)會、中國農(nóng)學(xué)會食用菌分會.第九屆全國食用菌學(xué)術(shù)研討會摘要集[C]. 中國菌物學(xué)會、中國農(nóng)學(xué)會食用菌分會, 2010: 2.

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2095-0934（2017）03-163-03

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助（CARS-24）

*通訊作者：張友民，男，教授，現(xiàn)從事植物學(xué)和植物生態(tài)研究工作。E-mail：zhangymf@yahoo.com.cn