轉基因成分定量檢測技術研究進展

杜智欣,焦 悅,張亮亮,朱鵬宇,付 偉,*

(1.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100029;2.廣西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,廣西南寧 530021;3.農業部科技發展中心,北京 100125;4.海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,海南?？?570311)

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轉基因成分定量檢測技術研究進展

杜智欣1,2,焦 悅3,張亮亮4,朱鵬宇1,付 偉1,*

(1.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100029;2.廣西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,廣西南寧 530021;3.農業部科技發展中心,北京 100125;4.海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,海南?？?570311)

轉基因作物的種類以及含有轉基因成分的產品在日益增長,轉基因產品的安全性也越來越被社會公眾廣泛關注。世界各國均頒布轉基因安全管理、標識法規,對轉基因生物及其加工產品進行標識和管理。如何準確、穩定地對轉基因產品中的轉基因成分進行定量,已成為轉基因產品檢測技術研究的重要方向。本文綜述了競爭性PCR、熒光定量PCR以及數字PCR等定量檢測技術在轉基因成分檢測中應用及研究進展,討論了目前各類轉基因定量檢測技術的優缺點,并在此基礎上展望了定量檢測技術在轉基因成分檢測領域的發展前景。

轉基因,定量檢測,PCR,數字PCR

基因工程的飛速發展使越來越多地轉基因產品進入人們的日常生活。轉基因產品食用和環境安全性的爭議也越來越強烈[1-2]。包括歐盟國家在內超過60個國家地區以及國際組織已經制定了相關的法律法規[3],要求對轉基因生物及其產品進行標識管理,用以維護消費者的知情權。

標識的閾值是指產品中含有的轉基因作物的百分比。世界各國在設定轉基因食品標識閾值時,除了考慮科學因素外,還要結合經濟、社會、人文等因素,進而通過閾值來集中體現一個國家和地區對轉基因安全風險的相應忍受程度[4]。其中,歐盟新頒布EC No 1829/2003和No 1830/2003中規定所有轉基因成分含量超過0.9%的食品和飼料都必須進行強制性標識;澳大利亞、新西蘭、以色列、捷克共和國、沙特阿拉伯等國家的閾值為1%;智利的閾值是2%;韓國、馬來西亞等閾值為3%;日本、泰國、印尼、中國臺灣等國家和地區規定的標識閾值為5%[5-6]。以美國為代表,加拿大、阿根廷等國家對于轉基因食品的標識管理施行自愿性標識。中國目前采取的是零容忍的強制性標簽制度,沒有設定具體的閾值,只要是符合2002年頒布《農業轉基因生物標識管理辦法》中規定的5類17種轉基因產品必須進行標識。但是不可否認,我國轉基因安全管理實施定量標識和閾值管理是未來發展的必然趨勢[7]。因此我國需提高定量檢測技術水平以達到國際社會對轉基因作物及其相關產品的檢測水平。

標識制度不斷發展和完善也促使轉基因檢測方法從定性到定量的發展,快速、靈敏、準確的定量檢測技術已經成為轉基因生物及其產品檢測方法研究的重點,是安全管理和標識法規實施的技術支撐。目前在轉基因定量檢測過程中,由于核酸的穩定性要高于蛋白質,因此以核酸為靴標的檢測技術成為定量轉基因成分檢測的首選技術。本文主要通過探討定量檢測技術在轉基因檢測領域方面的應用,旨在提出轉基因定量檢測技術未來發展的趨勢和研究方向。

1 定量PCR檢測技術在轉基因產品定量檢測中的應用

1.1 競爭性定量PCR檢測技術

競爭性定量PCR(competitive quantitative PCR,QC-PCR)采用同目標DNA相同動力學特點和擴增效率的DNA模板(DNA競爭模板)與樣品混合在同一體系中,使它們競爭反應體系中相同的底物與引物,同時以不同稀釋梯度的競爭DNA模板建立標準曲線,再通過標準曲線可以計算待測DNA的含量[8]。該方法初期主要針對單一外源基因進行定量檢測,如針對一代抗草甘膦大豆農達和玉米Bt11、Bt176品系建立了啟動子和終止子的QC-PCR方法[9],以及Hardegger等建立了針對35S啟動子和NOS終止子的競爭性PCR檢測體系[10]。隨后,QC-PCR方法經毛細管電泳激光誘導熒光技術(Capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence,CE-LIF)進行檢測,實現了玉米Bt176品系的雙重定量檢測[11]。Mavropoulou等[12]將PCR產物與微孔板中預先包被的靶基因雜交用以代替凝膠電泳可以同時檢測轉基因大豆的內源基因lectin與外源35S啟動子,其中外源35S啟動子的檢測限可達24拷貝。此外,基于光譜自編碼微球的高通量篩選技術也被引入QC-PCR檢測體系中,并應用于轉基因成分定量檢測分析,可同時檢測包含內源基因在內的4個靶基因,檢測限可達500拷貝[13]。競爭性定量PCR實驗原理巧妙而嚴謹,可以有效地降低實驗室間的誤差,進而得到較為可靠的定量結果,但是競爭性DNA制作工序復雜,需要進行反復測試進而達到一定的穩定性。同時每次實驗都要針對檢測目標的不同而做多種標準品對照,工作量大。此外,競爭性模板與目的模板擴增效率很難做到完全一致,這對實驗結果的準確性會產生一定的影響。故此該方法受到初始標準品質量的影響非常大,如果不能把前期競爭性DNA制作轉化為商業化運作,將很難適應日常大批量高通量的檢測應用。

1.2 實時熒光定量PCR檢測技術

實時熒光定量PCR(Real Time Quantitative PCR or Taqman PCR or qPCR)是現如今得到廣泛認可和應用的定量PCR檢測技術[14-15]。該技術建立在熒光能量傳遞技術(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)的基礎之上,在PCR反應體系中加入非特異性熒光染料(如:SYBR Green I、Eva Green、LC Green和SYTO9等)或者特異性的熒光探針(如TaqMan探針、TaqMan-MGB探針、Allglo探針、LNA、FRET、分子信標等),通過實時監測熒光量的變化,獲得待測樣品達到熒光檢測閾值的循環數(cycle threshold,Ct值)。再根據已知濃度標準品的Ct值與其濃度對數成負線性相關關系這一原理,建立標準曲線。進而計算出樣品中模板DNA的濃度[16]。Vaitilingom等[17]于1999年首次將該技術應用到轉基因產品的定量檢測上。近年來,實時熒光定量PCR被廣泛應用于大豆[18]、玉米[19]、水稻[20]、番茄[21]、小麥[22]、棉花[23]、柑橘[24]等轉基因植物的目的基因定量檢測。同時,DNA提取技術的不斷更新換代,促進了熒光定量PCR技術在深加工產品中的應用,如發酵豆制品[25-26]、糧油[27]、飼料[28]等。而隨著規模化、實用化轉基因技術的發展,多重擴增技術和實時熒光定量技術整合到一起,可對多個目的基因進行同時檢測。但是在同一反應體系中,多對引物和探針之間存在相互抑制以及熒光通道的限制,目前建立的多是應用于轉基因產品的篩選檢測方法,Cottenet等針對47個檢測目標的轉基因成分最多可以做到24重實時熒光PCR篩選技術[29],而已報道的實時熒光多重PCR定量檢測方法大多僅限于三重[30-31]。我國汪秀秀[32]采用錨定核苷酸探針(Locked Nucleic Acid,LNA)結合四個熒光通道(FAM、HEX、ROX和CY5)的實時熒光PCR擴增技術,建立了可以最多同時定量檢測轉基因棉花品系GHB119、T304-40、棉花內源基因ACP1與Cry2Ae蛋白基因的四重實時熒光定量PCR檢測方法。不可否認經過多年的發展,實時熒光定量PCR已經是現階段轉基因產品定量檢測方法中快速、高效、準確的代表。但從定量原理上來講,實時熒光定量PCR對于目標DNA模板的定量主要分為絕對定量和相對定量兩種。絕對定量是指用己知標準品制作的標準曲線來推算未知樣品的模板量。相對定量則是指是在目標模板序列相對于另一參照樣品序列的變化。不難看出,兩種定量方法都極度依賴于標準品,故此針對現行商品化轉基因產品大力開發標準物質并建立相關質量評估組織是保持該定量方法更為廣泛應用的主要手段。另一方面,還有一些轉基因產品沒有經過任何批準混入市場。這些未知轉基因產品中修飾DNA序列的相關信息一般由研究院所以及公司作為不公開信息保存,很難有針對性對其進行有效的檢測,這將是現行主流定量檢測發展的一個最大的挑戰。此外,在實際檢測過程中,由于熒光定量PCR體系較為封閉,耐受性差等因素,擴增閾值變化幅度較大,因此無論是準確度還是重現性在某些時候仍然存在誤差較大的問題。

1.3 數字PCR定量檢測技術

數字PCR(digital PCR,dPCR)是繼普通PCR技術和熒光定量PCR技術之后的第三代PCR技術,是一項針對單分子目標DNA的絕對定量分析技術。該技術一般需要先將核酸模板稀釋,并平均分配到幾十至幾萬個單元中進行反應,理論上使每個反應單元中只有單個模板分子,然后在每個反應單元中獨立地進行擴增反應。擴增結束采用泊松概率分布公式等統計學公式分析熒光信號陽性的反應單元占所有反應單元的比例來計算初始樣品中目標核酸的精確拷貝數[33-35]。相較于傳統PCR,數字PCR的靈敏度很大程度上取決于反應單元的數目。反應單元的數目越多,數字PCR的靈敏度和準確度也越高。目前,根據反應單元形成的不同方式,商業化的數字PCR技術主要包括芯片式數字PCR(chip digital PCR,cdPCR)和微滴式數字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)兩類數字PCR系統。ddPCR源于乳液PCR(emulsion PCR)技術[36-37],主要由Bio-Rad和RainDance公司進行商業化開發,利用微滴發生器可以一次生成2萬個納升級(QX200TMDroplet Digital PCR System)或1千萬個皮升級(RainDropTMDigital PCR System)的微滴。cdPCR則通過微流控等技術被均勻導入芯片上的反應倉或微孔中進行PCR反應,然后通過類似于基因芯片的方法掃描每個反應倉或者通孔的熒光信號,進而計算目的序列的含量。以Fluidigm公司的BioMarkTMHD System系統(1萬～4萬反應倉)以及ThermoFisher Scientific公司的QuantStudioTM3D Digital PCR System系統(2萬微孔)為代表。

cdPCR和ddPCR這兩類主流的商業化數字PCR技術都已應用于轉基因成分定量檢測。Burns等[38]利用cdPCR進行轉基因樣品含量分析并發現該平臺檢測限達到5拷貝;Pérez Urquiza等[39]應用Fluidigm與ThermoFisher兩個公司cdPCR系統平臺對玉米MON 810、大豆GTS 40-3-2、小麥DREB1A/acc1三個轉基因品系進行對量分析。胡佳瑩等[40]以轉基因玉米MON863混合樣品為例建立了基于單重和雙重cdPCR體系的轉基因樣品含量分析方法。ddPCR在實際應用方面更為廣泛,已在玉米[41-44]、水稻[45-46]、大豆[42,47]、深加工產品[48-49]中的轉基因成分定量檢測中進行驗證。另一方面,dPCR特異性強、靈敏度高、穩定性好,是良好的計量平臺。常被用作評估質粒標準品以及其他標準物質的轉基因成分拷貝數比例[50-53]。數字PCR作為最新的絕對定量方法能準確定量單分子目標DNA,可以說該方法的出現,有效彌補了熒光定量PCR方法在定量檢測方面高度依賴標準物質以及擴增效率不一致等不足,為轉基因產品檢測限量或閾值設定提供了新的度量標尺[54]。

但是,當前的數字PCR技術,無論是微滴還是芯片,由于內部設計精密和復雜的特征導致其每次檢測成本極其昂貴,長期大規模使用費用太高,非一般實驗室或者公司能夠承受,這也是該方法不能普及的最主要限制因素。相信未來隨著技術的不斷更新,低成本的數字PCR產品被開發出來,應用范圍會越來越廣泛。

2 酶聯免疫吸附法在轉基因產品定量檢測中的應用

酶聯免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)是以抗原、抗體為基礎的免疫學方法,通過特異性檢測外源蛋白來定性、定量檢測轉基因產品。該方法借助于酶標儀可根據已知標注物質的一系列濃度梯度與吸光度值來制作標準曲線,以此確定樣品中轉基因蛋白的含量,但只能達到半定量檢測的水平[55]。Roland等[56]早在1992年就將ELISA技術用于轉基因植物中nptII基因表達產物的定量分析。白衛濱等[57]以抗草甘膦轉基因大豆為材料,建立了檢測表達CP4EP-SPS蛋白的ELISA定量方法。Kim等[58]采用ELISA檢測技術對轉基因胡椒中外源基因不同時間表達效率進行了定量比較研究。Kamle以及王新桐等分別針對轉基因棉花Bt基因表達蛋白和nptII基因表達蛋白建立了雙抗體夾心酶聯免疫吸附定量檢測方法[59-60]。

ELISA法具備酶反應的高靈敏度和抗原抗體反應的特異性,同時還可以與PCR相結合,將PCR擴增產物與標記探針進行雜交,再與抗體特異性結合,并使底物顯色,可以根據吸光值的標準曲線進行半定量分析,具有操作簡單,費用低、特異性好,可實現高通量檢測的優點。但ELISA法本身易出現本底過高,以及如保溫時間的差異、洗滌方法不同等相關因素都有可能導致檢測結果出現偏差,在實際操作中只能檢測有限種類未加工的轉基因產品[61]。

3 討論與展望

轉基因生物的安全性管理是一個全球性的問題,特別是隨著經濟全球化和國際貿易的不斷發展,各個國家和地區在轉基因產品的閾值范圍、標識方式等管理制度上的差異已經成為轉基因產品國際貿易中最主要的技術貿易壁壘之一[54]。因此,如何精確地對轉基因產品中的轉基因成分進行定量,在國際上推行統一含義的閾值,是許多國際組織努力的目標[62]。從定量的角度來看,基于外源蛋白質檢測方法由于缺乏成熟轉基因產品的內源蛋白作對照,不能精確測定轉基因含量[63],此外,蛋白質基礎上檢測方法存在操作繁瑣、穩定性差等缺點,比如說轉基因深加工產品,由于經過高溫,外源蛋白在加工過程中容易失活或分解,造成檢測結果假陰性概率大大增加。因此以核酸為靴標的檢測技術成為定量轉基因成分檢測的主要研究和使用的方法[64-65]。

PCR方法是目前最準確的應用于轉基因植物檢測的方法[66-68],定量PCR方法經歷了競爭性定量PCR到熒光定量PCR以及現如今數字PCR的過程,其中競爭性定量PCR從嚴格意義上講是一種半定量的方法,雖然對實驗儀器的要求不高,但實驗的關鍵技術需要利用基因重組技術構建標準競爭DNA,每次檢測需要多個標準樣品作對照[61],既不適合檢測高通量的樣品,同時對于一般實驗室來說有很大難度。熒光定量PCR技術作為目前現行的轉基因產品定量的核心技術而被廣泛使用[70-71]。但是也不能忽視其方法應用的限制,該方法主要是依靠參照標準曲線和標準物質進行拷貝數定量分析[72],僅能實現相對定量分析,這就必然會受到標準物質發展以及質量評估建立滯后的限制[73],另外,熒光定量PCR對DNA模板純度和PCR抑制因子等因素很敏感,在復雜體系中會導致定量的不準確[72],定量分析通量較低[48]。此外,實時定量PCR的定量并不夠直接,它一般需要標準曲線來將含量轉化為絕對的濃度,而這些濃度不同實驗室間不確定度較大。實時定量PCR也難以檢測那些微小的拷貝數目變化,靈敏度有限[74]。數字PCR不像熒光定量PCR技術需要全程收集熒光信號,而是分成兩部分,前期PCR擴增和后期熒光信號分析,即在PCR終點進行熒光信號的檢測和計數統計,整個過程既不依賴擴增曲線的循環閾值,也不需要標準物質的參與便可實現絕對定量檢測,避免了因為復雜樣品與純的標準品之間核酸提取效率和擴增效率不一致而引起的偏差[48,50,75];同時數字PCR將傳統PCR指數數據轉換成數字信號,能減小普通定量PCR反應的影響因素[50,76],對樣品DNA純度的要求更低[38];靈敏度和重復性相對普通定量PCR都有較大提高[38,77-80]。

綜上所述,轉基因生物安全不斷拔高的關注度以及閾值管理的不斷完善直接推動著轉基因檢測技術由半定量到精確定量、絕對定量,檢測效率及自動化程度越來越高?，F階段,熒光定量PCR技術在國內外轉基因產品定量檢測方法中仍然占主導地位,但是隨著全球已商業化的轉基因作物逐年增加,部分制定的轉基因檢測技術標準以及標準物質根本無法完全覆蓋到所有的轉基因作物品系,對于一些已研制出來即將通過安全認證的轉基因新品種的檢測,更是缺乏相關的序列信息和相關技術規程。因此,相對于轉基因新品種及轉化事件的不斷增多,其針對性的背景信息收集和標準物質的發展則顯得格外重要。另一方面,數字PCR在已經報道的轉基因定量檢測研究中表現出更高的靈敏度和穩定性,是未來轉基因定量檢測技術的發展趨勢。

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Development of quantitative detection techniques of genetically modified organisms

DU Zhi-xin1,2,JIAO Yue3,ZHANG Liang-liang4,ZHU Peng-yu1,FU Wei1,*

(1.The Institute of Plant Quarantine,Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100029,China;2.Guangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanning 530021,China;3.Science and Technology Development Center,MOA,Beijing 100125,China;4.Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Haikou 570311,China)

The concern of public has been more and more focus on the safety of the Genetically Modified Organisms(GMO)as the rapid development of transgenic techniques and uncertain effect to human beings and environment. Different countries and organizations have declared kinds of safety and labeling laws to achieve the proper regulation to the commercialization of the GM products. In this manner,the achievement of stable and accurate quantitation of GMO content within different kinds of commercialized product has become the key point of the development of GMO detection techniques. In this paper,the application and development of different quantitative detection methods were summarized,such as competitive PCR,real-time PCR,digital PCR and etc. Meanwhile,the advantages and drawbacks of different detection methods were discussed and the future of the quantitative detection methods in the area of GMO content quantitation were predicted.

transgenic;quantitative detection;PCR;digital PCR

2016-10-18

杜智欣(1980-),男,博士,農藝師,研究方向:轉基因生物安全,E-mail:57204302 @qq.com。

*通訊作者:付偉(1983-),女,博士,副研究員,研究方向:轉基因生物安全,E-mail:fuwei0212@163.com。

TS201.2

A

1002-0306(2017)10-0379-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.065