高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒配方羊奶粉中酪蛋白磷酸肽含量

高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒配方羊奶粉中酪蛋白磷酸肽含量

文/李則均

（黑龍江完達(dá)山乳品有限公司）

采用高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒配方羊奶粉中酪蛋白磷酸肽（CPPs）含量。樣品前處理采用超聲提取，鹽酸調(diào)節(jié)pH值4.4～4.6沉淀酪蛋白。流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液和乙腈梯度洗脫。試驗(yàn)結(jié)果表明，在波長(zhǎng)254 nm條件下，目標(biāo)物CPPs保留時(shí)間為24.408 min。試驗(yàn)使用檢出范圍為30～300 μg/mL，在此范圍內(nèi)CPPs呈良好的線性，線性回歸方程y=375.82x+7385.4，R2＞0.9997。加標(biāo)回收率在96.8%～107.3%。試驗(yàn)的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3，相對(duì)偏差為0.49%。

酪蛋白磷酸肽（CPPs）；紫外高效液相色譜法；嬰幼兒配方羊奶粉

酪蛋白磷酸肽簡(jiǎn)稱CPPs，是用胰酶或胰蛋白酶水解的酪蛋白，其核心結(jié)構(gòu)為絲氨酸、谷氨酸、磷酸基。CPPs在中性和弱堿性環(huán)境下能與鈣結(jié)合，避免鈣的流失，促進(jìn)鈣的吸收。CPPs對(duì)鈣促吸收的作用主要表現(xiàn)在促進(jìn)小腸對(duì)鈣的吸收利用，促進(jìn)牙齒、骨骼發(fā)育。CPPs還對(duì)鐵、鋅有很好的吸收利用效果。CPPs是從天然蛋白質(zhì)中提取的多肽，具有不良反應(yīng)小、安全可靠、致敏率低等特點(diǎn)。嬰幼兒配方羊奶粉營(yíng)養(yǎng)成分更接近人乳，更易被人體吸收，因此近年來(lái)嬰幼兒配方羊奶粉擁有廣闊市場(chǎng)。綜上所述，在嬰幼兒配方羊奶粉中添加CPPs有很廣泛的前景。

CPPs的測(cè)定方法一般采用LC-MS或者毛細(xì)管區(qū)帶電泳法。前者檢測(cè)成本高，不適用于企業(yè)批量生產(chǎn)的嬰幼兒配方羊奶粉中CPPs的測(cè)定。后者操作復(fù)雜，嬰幼兒配方羊奶粉含有強(qiáng)化鈣、鐵、鋅等金屬鹽類成分，CPPs與這些鹽類成分相干擾，很難測(cè)定。本文采用高效液相色譜法，嘗試建立一種高效更適用于嬰幼兒配方羊奶粉中CPPs的含量測(cè)定方法。

1 材料方法

1．1 儀器與標(biāo)準(zhǔn)品

1．1．1 儀器

高效液相色譜：PE紫外檢測(cè)器。

表1 梯度洗脫條件

數(shù)控超聲波清洗器：K Q-1000DB，昆山市超聲儀器有限公司。

pH計(jì)：METTLER TOLEDO生產(chǎn)MP220。

1．1．2 標(biāo)準(zhǔn)品

CPPs：AflaTest LEVELOPER生產(chǎn)。

1．2 試劑

超純水：Millipore純水機(jī)制備；甲酸：CNW生產(chǎn)，色譜純，濃度0.1%；乙腈：DiKMA生產(chǎn)，色譜純；鹽酸：濃度1 mol/L。

1．3 預(yù)處理方法

稱取CPPs的嬰幼兒配方羊奶粉5.0 g于100 mL燒杯中，用40～50℃30 mL超純水溶解。樣品超聲10 min，超聲溫度40 ℃。用1.0 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液酸度pH值4.5±0.1，溶液定容置于50 mL容量瓶。濾液過(guò)0.45 μm濾膜，待用。

2 分離條件

2．1 色譜柱

Agilent Eclipse生產(chǎn)的SBC18，5 μm，4.6×250 mm。

2．2 流動(dòng)相

A：0.1%甲酸；B：乙腈。梯度洗脫，洗脫條件見(jiàn)表1。

2．3 進(jìn)樣量

100 μL。

2．4 檢測(cè)波長(zhǎng)

254 nm。

3 結(jié)果與分析

3．1 嬰幼兒配方羊奶粉中CPPs目標(biāo)峰的確定

采用相同前處理方法分別對(duì)CPPs標(biāo)準(zhǔn)品、不含CPPs的空白羊奶粉以及CPPs添加量為300 mg/100 g的羊奶粉進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1～圖3。通過(guò)圖1分析，CPPs目標(biāo)峰保留時(shí)間初步確定為24.40 min，在該保留時(shí)間內(nèi)易排除前段梯度洗脫物干擾，又具有很好的響應(yīng)強(qiáng)度，與其它峰得到較好的分離。經(jīng)過(guò)空白對(duì)比試驗(yàn)，表明在CPPs保留時(shí)間內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到干擾峰，又驗(yàn)證了此方法的有效性（圖2）。因此可以根據(jù)圖3確定CPPs目標(biāo)峰的保留時(shí)間24.408 min。

用該方法對(duì)添加CPPs的完達(dá)山牌嬰幼兒配方羊奶粉，進(jìn)行了4 批不同生產(chǎn)批次檢測(cè)，得到色譜圖圖4～7。通過(guò)對(duì)色譜圖分析得出，該檢測(cè)指標(biāo)在不同批次CPPs產(chǎn)品譜圖有很好的重現(xiàn)性，其可作為幼兒配方羊奶粉中CPPs的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

圖1 CPPs標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

圖2 不含CPPs的空白奶粉圖譜

圖3 添加CPPs嬰幼兒配方羊奶粉圖譜

圖4 添加CPPs 1批次嬰幼兒配方羊奶粉圖譜

圖5 添加CPPs 2批次嬰幼兒配方羊奶粉圖譜

圖6 添加CPPs 3批次嬰幼兒配方羊奶粉圖譜

圖7 添加CPPs 4批次嬰幼兒配方羊奶粉圖譜

表2 CPPs標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與對(duì)應(yīng)峰面積

3．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

試驗(yàn)的使用檢出范圍為30～300 μg/mL，線性回歸方程y=375.82x+7 385.4，R2＞0.9997，見(jiàn)表2和圖8。

標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)濃度為3 0 μg/mL，一般幼兒配方奶粉中添加CPPs含量為奶粉中鈣含量的0.3～0.5 倍，大部分鈣強(qiáng)化劑鈣含量都大于1%，即CPPs含量大于0.3%，因此檢出限為30 μg/mL能滿足檢測(cè)要求。

3．3 精密度

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3，符合要求，在重復(fù)條件下獲得5 次獨(dú)立試驗(yàn)結(jié)果的絕對(duì)差值與算數(shù)平均值的比值為0.49%，符合要求（＜5%），結(jié)果見(jiàn)表3。

圖8 CPPs標(biāo)準(zhǔn)曲線

3．4 回收率

回收率試驗(yàn)選取沒(méi)有添加過(guò)CPPs的奶粉作空白，分別添加檢出限濃度30 μg/mL 、標(biāo)準(zhǔn)曲線0.3濃度100 μg/mL和標(biāo)準(zhǔn)曲線0.7濃度250 μg/mL進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)得回收率見(jiàn)表4。總回收率為100.5%，30 μg/mL的回收率較高為105.7%，100 μg/mL的回收率為98.2%，250 μg/mL的回收率為97.6%。濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線中間部分的回收率較穩(wěn)定。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

表4 回收率試驗(yàn)

4 討論

4．1 本文采用的測(cè)定嬰幼兒配方羊奶粉中CPPs含量的方法，前處理簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，回收率高，適合企業(yè)批量生產(chǎn)嬰幼兒配方羊奶粉中CPPs的檢驗(yàn)。羊奶粉中蛋白成分復(fù)雜，干擾因素多，本方法通過(guò)梯度洗脫，較好的分離了CPPs，因此本方法還可以用于其它食品中CPPs的測(cè)定。

4．2 在前處理階段，用較熱的純水溶解樣品有利于提高CPPs測(cè)定含量。梯度洗脫對(duì)于機(jī)器平衡要求很高，一般以初始流動(dòng)相比例最好平衡2 h以上，再進(jìn)行樣品的測(cè)定。由于夏季溫度和冬季溫度差異較大，在洗脫階段適當(dāng)調(diào)節(jié)B流動(dòng)相比例。

4．3 本文前處理采用等電點(diǎn)沉淀蛋白去除干擾成分，操作簡(jiǎn)單，采用高效液相色譜法測(cè)定CPPs含量定量準(zhǔn)確，適合批量檢測(cè)。C

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Determination of the Content of Casein Phosphopeptides（CPPs）in Infant Formula Using High Performance Liquid Chromatography

LI Ze-jun
（Heilongjiang Wondersun Dairy Co. Ltd.）

High performance liquid chromatography was used to determine the content of CPPs in infant formula. The samples were pretreated by ultrasonic extraction，and pH was adjusted to 4.4～4.6 by hydrochloric acid to precipitate casein. The mobile phase was eluted with a gradient of 0.1% formic acid in water and acetonitrile. The experimental results showed that the retention time of CPPs was 24.408 min at 254nm. The linear range was 30～300 μg/mL，and the linear regression equation was y=375.82x+7385.4，R2>0.9997. The recoveries ranged 96.8%~107.3%. The calculated standard deviation was 3.3 and the relative deviation was 0.49%.

casein phosphopeptides（CPPs）；UV - high performance liquid chromatography；infant formula sheep powder

李則均（1983-），女，工程師，主要從事質(zhì)量分析工作。

2016-10-13）