ACE C-結構域選擇性抑制二肽與ACE結構域的結合模式

管 驍，洪延涵，劉 靜，李景軍，孫 注，韓 飛

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.上海海事大學信息工程學院，上海 201306；3.江蘇長壽集團有限公司，江蘇 無錫 226500；4.內蒙古燕谷坊生態農業發展（集團）有限公司，內蒙古 呼和浩特 201106；5.國家糧食局科學研究院，北京 100037）

ACE C-結構域選擇性抑制二肽與ACE結構域的結合模式

管 驍1，洪延涵1，劉 靜2，李景軍3，孫 注4，韓 飛5

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.上海海事大學信息工程學院，上海 201306；3.江蘇長壽集團有限公司，江蘇 無錫 226500；4.內蒙古燕谷坊生態農業發展（集團）有限公司，內蒙古 呼和浩特 201106；5.國家糧食局科學研究院，北京 100037）

IW（Ile-Trp）、VW（Val-Trp）是兩種對人體體細胞ACE（somatic ACE，sACE）中的C-結構域（C-domain）具有選擇抑制性活性的食源性二肽，但其與ACE兩個結構域（包括C-domain和N-domain）的結合模式與分子機制尚不明確。本實驗采用分子柔性對接技術分別對上述兩種肽與靶標的作用位點、結合能及作用力類型等進行研究。對接結果表明，IW、VW與ACE C-domain的活性位點存在氫鍵、親水、疏水相互作用力及配位鍵，與N-domain作用模式相似，但生成氫鍵數目較少，且與Zn2＋不產生靜電相互作用。通過比較IW、VW分別與兩個結構域結合的能量差異，證明IW、VW針對兩個結構域有不同的抑制強度，可為指導開發ACE C-domain選擇性抑制肽提供理論參考。

ACE；C-domain 選擇性抑制肽；柔性對接；結合模式

血管緊張素轉化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）是一種含鋅的二肽羧肽酶，可催化無活性的血管緊張素（angiotensin，Ang）Ⅰ轉化為強烈收縮血管的血管緊張素Ang Ⅱ，同時可水解具有舒張血管作用的舒緩激肽[1-2]，導致人體血壓升高。人體內的ACE以兩種形式存在：體細胞ACE（somatic ACE，sACE）和睪丸ACE（testic ACE，tACE）。特別是sACE在各種組織中普遍存在，由兩個高度同源的蛋白結構域N、C-domain組成，各包含一個活性序列His-Glu-X-X-His（HEXXH）和Zn2＋[3-4]。兩個結構域擁有60%的序列相似性，但在底物和抑制劑的特異性及氯離子激活等方面存在較大差異[5-7]。前人研究表明，將無活性的Ang Ⅰ水解為具有強烈收縮血管作用的Ang Ⅱ是專一通過sACE的C-domain完成的，N-domain無此功能；而對具有舒張血管作用的舒緩激肽的水解則可通過兩個結構域同時完成[8]。

當前所認識的絕大多數ACE抑制肽都屬結構域混合型抑制肽（同時抑制兩個結構域活性），在抑制ACE活性的同時也導致了舒緩激肽的積累，過量的舒緩激肽易導致干咳、嘔吐、皮疹等副作用[9]。從理論上講，ACE C-domain選擇性抑制肽既可有效抑制Ang Ⅱ的生成，又保留了ACE N-domain水解舒緩激肽的活性，是副作用更小、安全性更高的預防與控制心血管疾病的藥物[10-11]。最新的研究發現IW（Ile-Trp）、VW（Val-Trp）兩種二肽對ACE C-domain有特異性抑制作用[12-14]，但它們對ACE兩個結構域作用的分子機制尚未明確。本實驗以這兩種選擇性抑制肽為研究對象，通過與ACE兩個結構域柔性對接結果的分析闡明其結合模式與選擇性抑制作用機制，為針對性設計ACE C-結構域選擇性抑制肽提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 初始結構的獲得及處理

從Protein Data Bank數據庫中下載ACE的C-domain與N-domain的X衍射三維結構數據，編號分別為1O86和2C6N[15-18]。結晶結構中還存在某些氨基酸殘基和原子的缺失，采用Discovery Studio2.5軟件（Accelrys公司）處理該蛋白質，刪除模擬過程中不需要的水分子和抑制劑小分子Lisinopril，保留Zn2＋和Cl－并優化蛋白質的結構。

1.2 小分子的生成及結構優化

以IW、VW為抑制劑研究對象，用MDL ISISDraw v2.5軟件（創騰科技有限公司）畫出IW、VW的結構式（圖1），加氫后糾正其結構并用Discovery Studio中的CHARMm[17-19]力場進行結構優化，得到最低能量結構。并利用DS 2.5中的Prepare Ligands處理該配體，使其產生三維結構及異構體。最終得到的結構保存為mol格式，用于分子對接。

圖 1 VW（A）、IW（B）的分子結構Fig. 1 Chemical structural formula of VW (A) and IW (B)

1.3 分子對接參數設置

所有計算工作均在HP Z620計算機工作站上完成。采用Discovery Studio2.5以分子柔性對接方法分別建立ACE的C-domain和N-domain與底物及抑制肽的分子對接模型，利用柔性對接可以較好模擬活性肽與ACE之間的誘導契合效應，使對接結果接近二者的真實構象[20]。C-domain中需補全的殘基為Ser435、Glu436、Gly437、Gly438，均位于蛋白酶的活性位點外。N-domain中沒有需補全的殘基。

依據DS對接程序，將ACE定義為受體，二肽設置為配體，C-domain的對接運行參數為：Radius（半徑）12 ?，三維坐標為X：40.90；Y：37.22；Z：46.13。活性位點的選擇基于文獻、軟件中的Define Site及復合物的結構數據。選用C-domain的His353、Ala354、Ser355、Ala356、Val380、His383、Glu384、His387、Phe391、Pro407、His410、Glu411、Asp415、Lys511、Phe512、His513、Ser516、Ser517、Val518、Tyr520、Arg522、Tyr523為活性位點殘基[16-17,21-23]。N-domain的對接運行參數為：Radius 12 ?，三維坐標為X：－26.39；Y：－20.78；Z：－35.88，對接區域殘基為：His331、Ser333、Ala332、Ala334、Val358、His361、Glu362、His365、Phe369、His388、Glu389、Asp393、Lys489、Phe490、His491、Val496、Arg500、Tyr501、Phe505[24-25]。用Flexible Docking 工具包將IW、VW分別對接到兩個結構域中，得到一系列結合配體構象。綜合考慮LibDockScore的高低、配體-受體復合物的CDocker Energy、CDocker Interaction Energy得分、軟件中打分函數（Ligscore 1、Ligscore 2、PLP1、PLP2、Jain、PMF、PMFO4）打分值的高低選取最優構象[26-28]。

2 結果與分析

2.1 VW與ACE的對接結果

2.1.1 VW與ACE C-domain對接結果分析

表 1 VW與ACE C-domain形成的最佳結合構象的氫鍵參數Table 1 Hydrogen bonds observed between the C-domain and the best pose of VW

圖 2 VW與ACE C-domain的相互作用圖Fig. 2 Interaction schemes between VW and the ACE C-domain

分析VW與ACE C-domain的分子對接結果，可以看到VW呈現一種蜷曲的構象深埋于C-domain的活性中心裂縫中，形成5個氫鍵（圖2a、b），最佳結合構象的氫鍵參數如表1所示。Ala354、Glu384各與VW形成兩個較強的氫鍵，為二者相互作用的關鍵氨基酸殘基，VW的N端氨基產生4 個氫鍵為舵手基團。VW的C端羧基與His383形成一個相對較弱的氫鍵，His383是ACE C-domain維持活性、調控血壓的主導性位點的重要氨基酸殘基，VW與His383的結合可抑制ACE與Zn2＋的結合。同時，VW與His513形成較強Pi鍵，鍵長5.40 ?；VW的N端氨基的氫原子與Glu384之間有靜電相互作用力產生；VW的O16與ACE的Zn2＋形成配位鍵，產生電荷相互作用。圖2c中圍繞在VW外面的不同濃度的灰度圖表示VW與蛋白之間的疏水相互作用力，疏水作用力的大小由顏色深淺度區分，顏色越淺表明疏水作用力越大。可以看到VW和C-domain的結合產生疏水作用，尤其在C-domain活性位點疏水區有疏水相互作用力。疏水作用由Ala354、Phe457、 Phe527和Val380等殘基形成。產生親水作用的氨基酸殘基有9 個：Gln281、His353、His383、Glu384、His387、Glu411、Asp415、Lys511、His513（圖2d）。VW中的吲哚芳環等疏水基團與C-domain的疏水氨基酸殘基形成了較強疏水作用，親水基團如羧基、氨基等參與了分子間親水作用的形成。

2.1.2 VW與ACE N-domain對接結果分析

表 2 VW與ACE N-domain形成的最佳結合構象的氫鍵信息Table 2 Hydrogen bonds observed between the N-domain and the best pose of VW

圖 3 VW與N-domain的相互作用圖Fig. 3 Interaction schemes between VW and the ACE N-domain

將VW對接到ACE的N-domain上，篩選出最佳對接構象（圖3a、b）。由圖中可以清晰看出VW結合于空腔內，與N-domain之間形成2 個氫鍵。Thr496與VW的氮端氨基形成一個較強氫鍵，Tyr501和肽鍵上的羥基形成一個弱氫鍵。Thr496、Tyr501為產生氫鍵的關鍵氨基酸殘基。與C-domain不同，VW與ACE N-domain之間的氫鍵作用相對較弱，產生氫鍵數目較少。具體氫鍵參數如表2所示。同時Tyr501與VW形成兩個較強Pi鍵，鍵長分別為4.38 ?和6.68 ?；His491與VW的氮端N20形成鍵長3.86 ?的Pi鍵。Lys489與VW形成強Pi鍵，鍵長2.31 ? 。ACE抑制劑的活性形態要求與ACE的Zn2＋結合的基團必須為—SH、COO—兩類，而VW中羧基中的氧原子與Zn2＋的距離為2.43 ?，大于氧原子（1.40 ?）與Zn2＋（0.74 ?）的共價半徑總和，意味著未形成配位鍵。圖3c中VW外圍的密布圖呈深灰表明VW與ACE的N-domain形成的疏水作用力較小。其中，Ala332、Ala334、Phe490、Phe435和Phe505是通過疏水作用力穩定復合物的構象；His491、Asn494、His331、Glu389、His361、Glu362、His365、Asp393通過親水作用影響兩者之間的關系（圖3d）。

2.2 IW與ACE的對接結果

2.2.1 IW與ACE C-domain對接結果分析

表 3 IW與ACE C-domain形成的最佳結合構象的氫鍵參數Table 3 Hydrogen bonds observed between the ACE C-domain and the best pose of IW

圖 4 IW與ACE C-domain的相互作用圖Fig. 4 Interaction schemes of IW with the ACE C-domain

將IW對接到ACE的C-domain中，最佳結合構象的結構圖如圖4a所示。圖中可以清晰看到IW位于疏水空腔中，與C-domain形成6 個氫鍵。由表3可看出，IW氮端氨基的H原子，在兩者相互作用中貢獻較大，為舵手基團，作為氫鍵供體與Ala354和Glu384形成4 個氫鍵，Ala354參與形成一個較強氫鍵，Glu384參與形成3 個強氫鍵，IW的肽鍵分別與Ala354和His513各形成一個氫鍵，故Ala354、His513和Glu384為產生氫鍵的關鍵氨基酸殘基。圖4b顯示Glu384與IW氮端氨基的氫原子形成靜電相互作用情況。IW通過C端羧基與酶活性位點處Zn2＋螯合，產生電荷相互作用，且Zn2＋與VW中羧基中的O原子距離為2.10 ?，表明形成配位作用。圖4d所示為IW周圍親水氨基酸及疏水氨基酸殘基分布圖。其中，與IW產生親水作用的ACE氨基酸殘基有7 個：His353、His383、Glu384、His387、Glu411、His513、His353、Arg522。產生疏水作用的ACE氨基酸殘基有6 個，由弱到強排序為Ala354、Ala356、Phe391、Phe512、Val380、Val518（疏水值1.8～4.2）。這些疏水性氨基酸產生了較強的疏水相互作用力（圖4c），形成的作用力將IW固定在C-domain的活性中心，對復合物的穩定起主要作用。

2.2.2 IW與ACE N-domain對接結果分析

表 4 IW與ACE N-domain形成的最佳結合構象的氫鍵信息Table 4 Hydrogen bonds observed between N-domain and the best pose of IW

圖 5 IW與ACE N-domain的相互作用圖Fig. 5 Interaction schemes of IW with the ACE N-domain

IW對接到ACE的N-domain中，按LibDockScore 降序排列，再綜合比較各個打分函數的打分值，最佳構象見圖5a。最佳結合構象的氫鍵參數如表4所示。IW的肽鍵上的氫原子與Ala332和Glu362分別產生兩個強氫鍵，且Glu362與IW氮端氨基的氫原子有靜電相互作用產生。His365作為與Zn2＋產生配位鍵的氨基酸殘基與IW的氮端氨基形成較強Pi鍵，鍵長4.29 ?。Lys489的NZ與IW形成鍵長4.51 ?的Pi鍵。Zn2＋與IW中羧基中的O原子距離為2.07 ?，表明有配位鍵產生。通過圖5c中圍繞在IW外的灰度圖看出IW與ACE N-domain之間形成較弱的疏水相互作用力，與IW產生疏水作用的氨基酸殘基由弱至強依次為Ala332、Ala334、Phe505、Phe490（疏水值1.8～2.8）；與IW產生親水作用的氨基酸殘基為：His491、His331、Arg500、Asp393、Glu389、His361、Glu362、His365。

綜合以上分析結果可知，IW、VW與ACE的C-domain作用機制相似，包括氫鍵、親水、疏水相互作用等方面，但在與N-domain的對接方式有所不同。通過比較可知IW、VW與C-domain結合產生氫鍵數目均多于各自與N-domain結合的氫鍵數，且氫鍵作用力均較強。在抑制劑與酶的結合過程中，氫鍵起穩定對接復合物的作用，氫鍵的數目決定了抑制劑對酶的親和力。因此IW、VW與C-domain具有更高的親和力，是IW、VW對ACE C-domain具有選擇性抑制的重要原因之一。Zn2＋在一定程度上也可促進酶與抑制劑的結合，IW、VW均能在C-domain與Zn2＋螯合以穩定構象，且產生靜電相互作用，靜電作用能分別為－79.45、－129.84 kJ/mol。IW在N-domain上雖然與Zn2＋螯合但沒有靜電相互作用，表現為較低的抑制活性，與體外活性實驗結果相符。另外，對兩種二肽而言，與C-domain、N-domain兩個結構域對接生成氫鍵的舵手基團基本相同，即二肽的N端氨基與肽鍵參與形成氫鍵，但二肽的N端氨基在ACE的C-domain上參與形成氫鍵數量較N-domain更多，可推測，二肽的氮端氨基酸在與C-domain結合比在N-domain中作用大。

2.3 二肽分別與C-domain和N-domain氨基酸殘基間的作用能分析

表 5 VW、IW與C-domain活性位點氨基酸殘基間的相互作用能Table 5 Electrostatic energy, van der Waals energy and total potential energy between the best poses of bioactive peptides obtained from docking results and the C-domain

為了驗證上述提出的結合模式，分別對不同結合體系的活性位點氨基酸殘基進行了結合自由能分解計算[29]。主要通過DS2.5中的“Calculate Interaction Energy protocol”模塊進行計算，在此，調用了經典的CHARMm力場進行計算。結果由表5可知，在ACE的C-domain與VW、IW分別相互作用過程中，Ala354、Ser355、His383、Glu384、Lys511、Phe512和His513的總電勢能對體系貢獻較大。對VW-C-domain結合體系分析，靜電力（－113.20 kJ/mol）比范德華力（－5.77 kJ/mol）對體系穩定起更大作用，特別是His513、Lys511、Ala354、His383和Glu384這些殘基與VW之間的靜電力起主導作用，分別為－12.64、－12.97、－16.50、－17.94 kJ/mol和－54.99 kJ/mol；His353和Ser355這兩個殘基對范德華力起主導作用（－3.31 kJ/mol和－3.73 kJ/mol）。

在IW與C-domain的相互作用中，靜電力同樣較范德華力起主導作用，Ala354、His383、Glu384和His513靜電力相對更低，特別是 Glu384與IW的靜電力能量負值最大（－48.21 kJ/mol），可能是因為與C-domain存在氫鍵作用。Tyr523表現出有利的范德華作用貢獻（－9.24 kJ/mol）。有研究證明[24]，若抑制劑能與Glu384以氫鍵結合，可抑制ACE與Zn2＋的結合，并使其失去血壓升高的能力，因此抑制劑與Glu384之間形成氫鍵作用至關重要。通過對C-domain活性位點周圍殘基的相互作用能計算及上述對接模式、氫鍵數目和強度等綜合分析，可知Ala354、Ala356、His383、Glu384、Lys511、Phe512、His513和Tyr523對復合物的穩定性影響較大，其中Ala354、His383、Glu384和His513作為C-domain活性位點關鍵殘基對復合物的穩定性貢獻最大。

表 6 VW、IW與N-domain活性位點氨基酸殘基間的相互作用能Table 6 Electrostatic energy, van der Waals energy and total potential energy between the best poses of bioactive peptides obtained from docking results and the N-domain

同理，VW、IW與ACE的N-domain相互作用能情況如表6所示。對于VW-N-domain結合體系，His331、Ala332、Ser333、Glu362、Phe490、His491、Tyr496、 Tyr498和Tyr501總電勢能對體系貢獻較大。其中Tyr496、Glu362、Tyr501、Tyr498、 Ala332和His491表現出十分有利的靜電力貢獻（－16.01、－14.29、－13.59、－10.84、－8.95 kJ/mol和－8.47 kJ/mol）。這與2.1.2節中預測的結合模式基本一致，Tyr496和Tyr501都與VW之間存在著氫健相互作用。另外，從表6可以看出Phe490和 Phe505具有較為有利的范德華力貢獻。在IW與N-domain的活性位點附近氨基酸殘基相互作用中，靜電力所起作用比范德華力大，Ala332、Asp393、Glu362和Lys489表現出明顯的靜電力作用（－12.32、－13.27、－25.04 kJ/mol和－33.25 kJ/mol）。通過對N-domain活性位點周圍殘基的能量分解值計算及上述對接模式、氫鍵數目和強度等綜合分析，可知His331、Ala332、Ser333、Glu362、Asp393、Lys489、Phe490、 Tyr496、Tyr498和Tyr501對結合體系穩定性有較大影響，特別是Ala332、Glu362、Lys489、Tyr496和Tyr501作為N-domain活性位點關鍵殘基對復合物的穩定性貢獻最大。

表 7 IW、VW與兩個結構域通過對接形成的最佳構象的結合能Table 7 Binding energy values of the best conf i gurations in IW and VW obtained by molecular docking at the two ACE domains

對比肽分別與兩個結構域的氨基酸殘基間的相互作用能可知，C-domain存在較多靜電貢獻大的殘基，且靜電作用強度比N-domain大得多。N-domain殘基范德華作用強度相對較大。一般來說，衡量一組配體和受體結合強弱可以通過結合能這一參數，對接預測結合能量越低，則表明活性肽與ACE間的結合越緊密[30]。利用DS2.5的“calculate binding energy”得到VW-C-domain和VW-N-domain的結合能分別為－248.83 kJ/mol和－135.83 kJ/mol，IW-C-domain和IW-N-domain的結合能分別為－221.44 kJ/mol和－160.13 kJ/mol（表7），由此說明VW、IW對C-domain的結合力更強，因此兩種肽均具有較好的C-domain選擇性抑制活性。另一方面，從VW與兩個結構域的結合能相對比較值來看，也高于IW，說明VW比IW具有更好的結構域選擇性抑制，這一分析結果與Lunow等[12]的實驗結果是一致的。

3 結 論

本實驗將兩個ACE C-domain選擇性抑制肽IW、VW分別與sACE的兩個結構域對接，通過對對接結果的分析， IW、VW與C-domain、N-domain的結合具有相似的分子作用機制。不同的是，在氫鍵、疏水相互作用上IW、VW與C-domain結合作用明顯強于N-domain，且IW、VW與C-domain的Zn2＋產生靜電相互作用，在N-domain上無該作用力。通過結合體系的相互作用方式以及氨基酸殘基的能量分解值可知，對C-domain活性起重要作用的殘基包括Ala354、His383、Glu384和His513；對N-domain活性起重要作用的殘基為Ala332、Glu362、Lys489、Tyr496和Tyr501。另外，通過比較復合體系的結合能，印證了IW、VW具有較好的C-domain選擇性抑制作用，且VW的選擇性抑制作用強于IW。以上研究可部分揭示ACE C-domain選擇性抑制肽的作用機制，給出選擇性抑制肽與ACE相互作用的直接證據，對進一步認識C-domain選擇性抑制肽與ACE的結合原理有一定的理論指導意義，對于以ACE C-domain為靶點的藥物設計提供了依據。

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Binding Modes between C-Domain Selective Angiotensin-Converting Enzyme (ACE) Inhibitory Dipeptides and ACE Domains

GUAN Xiao1, HONG Yanhan1, LIU Jing2, LI Jingjun3, SUN Zhu4, HAN Fei5
(1. School of Medical Instruments and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 2. College of Information Technology, Shanghai Maritime University, Shanghai 201306, China; 3. Jiangsu Longevity Group Co. Ltd., Wuxi 226500, China; 4. Inner Mongolia Yangufang Group Co. Ltd., Hohhot 201106, China; 5. Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037, China)

The C-domain selective angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory activities of food-derived dipeptides, including?Ile-Trp?(IW)?and?Val-Trp?(VW),?were?recently?verif i ed?by?experiments.?However,?their?interaction?modes?with?the?C-domain?and?N-domain?of?ACE?and?the?molecular?mechanism?remain?unclear.?In?the?present?study,?f l exible?molecule?docking technology was used to elucidate the active sites, interaction energy and intermolecular force types between the peptides and ACE. The results demonstrated that hydrogen bond, hydrophilic, hydrophobic and electrostatic interactions, and coordinate bond existed between the active pockets of the C-domain and IW and VW. The interaction of the N-domain with the peptides was similar to that of the C-domain, which had fewer hydrogen bonds and no electrostatic interactions. By calculating the binding energy difference between the two domains, we could seek the theoretical support for the different inhibitory potency of IW and VW. The above information will be helpful for the development of C-domain selective ACE inhibitory peptides.

ACE;?C-domain?selective?inhibitory?peptides;?f l exible?docking;?interaction?mode

10.7506/spkx1002-6630-201705026

O629.7

A

1002-6630（2017）05-0160-07

管驍, 洪延涵, 劉靜, 等. ACE C-結構域選擇性抑制二肽與ACE結構域的結合模式[J]. 食品科學, 2017, 38(5): 160-166.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705026. http://www.spkx.net.cn

GUAN Xiao, HONG Yanhan, LIU Jing, et al. Binding modes between C-domain selective angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory dipeptides and ACE domains[J]. Food Science, 2017, 38(5): 160-166. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705026. http://www.spkx.net.cn

2016-07-01

上海市自然科學基金項目（14ZR1419200）

管驍（1979—），男，副教授，博士，研究方向為食品功能與營養。E-mail：gnxo@163.com