干擾素誘導蛋白-10在肝源性糖尿病患者體內表達的研究

劉曉燕，呂 勇，王艷麗，朱金照，崔永良，熊 偉，吳旭偉，韓荔芬

干擾素誘導蛋白-10在肝源性糖尿病患者體內表達的研究

劉曉燕，呂 勇，王艷麗，朱金照，崔永良，熊 偉，吳旭偉，韓荔芬

目的探討干擾素誘導蛋白-10（interferon-inducibe protein 10, IP-10）在肝源性糖尿病患者肝組織及血清中表達水平，進一步探討其與肝源性糖尿病的關系。方法用ELISA、Real-time PCR以及免疫組織化學法檢測60例肝源性糖尿病患者及60例普通肝病患者血清及肝組織中IP-10的表達水平。結果在肝源性糖尿病患者中，ELISA法檢測血清中IP-10的表達水平為（239.542±28.603）pg/ml，明顯高于對照組的（205.341±26.952） pg/ml（P＜0.05）；Real-time PCR法檢測肝組織中IP-10 mRNA表達水平高于對照組（P＜0.05）。用免疫組織化學法檢測肝組織IP-10表達陽性率，肝源性糖尿病組為30.0%（18/60），高于普通肝病組的11.7%（7/60）（P＜0.05）。結論IP-10在肝源性糖尿病患者血清和肝組織中有著高水平表達。

干擾素誘導蛋白-10；肝源性糖尿病；炎癥因子

肝功能損害可造成機體糖原代謝紊亂和糖尿病的發生。有資料證明，約有50%～80%慢性肝病患者糖耐量降低，而其中的20%～30%最終可能會發展為糖尿病[1]。有數據表明，持續高血糖狀態會導致肝細胞損害甚至進展為肝衰竭[2]。干擾素誘導蛋白-10（interferon-induced protein 10, IP-10）是由干擾素刺激內皮細胞、單核細胞等誘導產生的能趨化T淋巴細胞的一類分泌性糖蛋白，又稱作CXC趨化因子配體10，目前國內外諸多關于IP-10的研究認為IP-10在各種炎癥因子介導的疾病中均有重要意義，但在肝源性糖尿病中的表達少有研究。本文通過檢測肝源性糖尿病患者血清及肝組織中IP-10的表達水平，探討其與肝源性糖尿病發生的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 所有取材均來自福建醫科大學孟超肝膽醫院肝組織穿刺標本和外科手術治療標本（外科手術標本為遠離病變組織的肝炎及肝硬化組織標本），按標本來源將患者分為2組：肝源性糖尿病組和普通肝病組，每組均包括普通肝炎患者30例和肝硬化患者30例，2組在性別、年齡、ALT水平、HBsAg定量、 HBV DNA定量方面差異無統計學意義，具有可比性（表1）。

1.2 診斷標準 患者均為HBV感染的慢性乙型肝炎患者和乙型肝炎肝硬化患者，其診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2015更新版）[3]的標準。肝源性糖尿病診斷：①有明確的肝病史且在糖尿病發生之前，或同時發生；②無糖尿病史及糖尿病家族史；③肝功能損害臨床表現明顯，并有客觀檢查證據支持；④符合糖尿病診斷標準：空腹血糖≥7.0 mmol/L，餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L；⑤胰島素釋放試驗：空腹胰島素水平偏高，餐后胰島素反應延遲或反應不良；血清C肽釋放試驗可正常或下降，C肽與胰島素的比值明顯減少；⑥肝功能的改變可導致血糖的惡化或好轉；⑦可排除其他疾病引起的血糖升高等糖代謝異常，包括無腎上腺、甲狀腺、垂體組織器官的疾病，排除藥物如降壓藥、利尿劑、避孕藥及糖皮質激素等引起的糖代謝紊亂等。同時排除心、腦、腎及其他器官嚴重功能不全者及并發其他嚴重疾病者[4]。

表1 2組基本臨床資料Table 1 Basic clinical data of 2 groups

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑 所用試劑為：血清IP-10 ELISA檢測試劑盒（美國Sigma公司），AMV第一鏈cDNA合成試劑盒（上海生工生物公司），SP超敏試劑盒（福州邁新生物技術開發公司），IP-10單抗（美國GeneTex公司），DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發公司）。

1.2.2 儀器 所用儀器為：全自動酶標儀EXL808（美國Bio-Tek公司），iCycle Real-time PCR儀iCyele（美國Bio-Rad有限公司），電腦全自動組織脫水機ZMN-9802（常州市華利電子有限責任公司），動組織包埋機ZMN-7803（常州市華利電子有限責任公司），石蠟切片機LEICARM 2128（德國Leica有限公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 ELISA法檢測血清IP-10水平 采患者空腹靜脈血5 ml，分離血清，用ELISA雙抗體夾心法檢測IP-10濃度。

1.3.2 Real-time PCR法提取總RNA 用RT-PCR及Real-time PCR對IP-10進行定性與定量的測定。IP-10引物序列：上游引物5′-CGA TTCTGA TTTGCTGCCTTA T-3′/下游引物5′-CTTCTCACCCTTCTTTTTCA TTG T-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH） 可用于RT-PCR反應的內對照。GAPDH引物序列為上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′/下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。反應條件均為95 ℃ 3 min；93 ℃ 1 min；57 ℃ 1min；74 ℃2 min，循環30次。74 ℃ 延伸10 min。可通過DNA測序證實PCR擴增產物為人IP-10。以肝組織標本中提取RNA反轉錄的cDNA為模板，在PCR反應體系中同時加入IP-10和GAPDH的特異引物，并進行擴增。lg cDNA/lg GAPDH比值可以代表標本中IP-10 mRNA的水平。

1.3.3 免疫組織化學（免疫組化）SP移動法檢測肝組織IP-10表達量 免疫組化SP法具有較高的敏感性，鏡下觀察有深褐色著色者為陽性，定位于胞膜和胞漿。

1.4 統計學處理 用SPSS 19.0軟件對數據進行處理，定量資料呈正態分布，用±s表示，2組比較用成組t檢驗。2組定性資料比較用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ELISA法檢測2組血清中IP-10水平 肝源性糖尿病組血清IP-10水平（239.542±28.603）pg/ml高于普通肝病組（205.341±26.952）pg/ml，差異有統計學意義（t=6.742, P=0.001）。

2.2 Real-time PCR法檢測肝組織中IP-10 mRNA的水平 IP-10 mRNA表達量用lg cDNA/lg GAPDH比值表示，肝源性糖尿病組肝組織IP-10 mRNA的水平（0.553±0.924）高于普通肝病組（0.264±0.647），差異有統計學意義（t=2.032，P=0.042）。

2.3 免疫組化法檢測肝組織IP-10表達陽性率 肝源性糖尿病組IP-10表達陽性率為30.0%（18/60），高于普通肝病組的11.7%（7/60）（χ2=6.110, P=0.016），見圖1。

3 討 論

目前認為肝源性糖尿病的發生與細胞因子調節有關。慢性肝病患者體內產生的細胞因子、炎性因子可能參與了糖代謝紊亂的發生機制，其中分泌胰島素的胰島β細胞在受到自身免疫攻擊時部分被破壞凋亡[5-6]。淋巴細胞作為炎癥細胞的一種，它在胰島β細胞的破壞中起著一定的作用，但是淋巴細胞由血液遷移至胰島炎癥部位的機制目前尚無定論。趨化因子是介導淋巴細胞遷移和定位的關鍵性因子，IP-10能被IFN-γ所誘導，主要與Thl細胞介導的免疫反應有關，并與T細胞膜上的CXCR-3結合，通過三磷酸鳥苷的消耗，使Gβγ 亞基二聚體解離出Gα亞基，使之具有調節活性，從而級聯激活多種酶，通過各種細胞通路，發揮吞噬、趨化、呼吸暴發、細胞脫顆粒等作用[7-9]。在肝細胞中產生IP-10，使之與CXCR-3結合，從而趨化單核細胞、活化NK細胞和T淋巴細胞，使NK細胞介導細胞死亡，以及T淋巴細胞附著血管內皮細胞，抑制血管生成等[10-12]。國外研究者曾利用IL-1β、INF-γ和dsRNA刺激體外培養的小鼠和人的胰島β細胞，檢測到高濃度的IP-l0，顯示炎癥性細胞因子和病毒能夠刺激胰島β細胞產生大量的IP-10[13-14]。因此IP-l0可能作為炎癥趨化因子在肝源性糖尿病發生中起一定的作用。在本研究中，應用ELISA、RT-PCR、免疫組化等方法檢測了血清及肝組織中IP-10表達水平，表明了肝源性糖尿病患者血清及肝組織中IP-10的表達水平均明顯高于普通肝病患者，驗證了IP-10通過炎癥機制在肝源性糖尿病的發生中可能起著一定的作用，當然，在本研究中還可以對患者病程中及治療前后IP-10水平進行分析，從而探討IP-10水平與肝源性糖尿病發展嚴重程度的關系。今后在進一步的研究中可擴大標本量增加普通肝病組的病種種類，為IP-10的表達水平在肝源性糖尿病發生中的作用尋找更多的循證醫學證據。

圖1 肝源性糖尿病患者肝組織IP-10免疫組化染色左圖.×100，右圖.×40Figue 1 Mmunohistochemical study of IP-10 in patients with hepatic diabetes

[1] Kuriyama S, Miwa Y, Fukushima H, et al. Prevalence of diabetes and incidence of angiopathy in patients with chronic viral liver disease［J］．J Clin Biochem Nutr, 2007, 40(2):116-122．

[2] Marchesini G, Ronchi M, Forlani G, et al. Cardiovascular disease in cirrhosis-a point-prevalence study in relation to glucose tolerance［J］. Am J Gastroenterol, 1999, 94(3):655-662.

[3] 中華醫學會肝病學分會，中華醫學會感染病學分會. 《慢性乙型肝炎防治指南》（2015更新版）［J］. 傳染病信息，2015，27(6):321-340.

[4] 姜麗萍，趙金滿. 肝源性糖尿病的診斷與治療［J］. 世界華人消化雜志，2007，15(6):617-621.

[5] Loetscher M, Gerber B, Loetscher P, et al．Chemokine receptor specific for IP-10 and mIG: structure, function, and expression in activated T lymphocytes［J］. Exp Med, 1996, 184(3):963-969.

[6] Gasperini S, Marchi M, Calzetti F, et al. Gene expression and production of the monokine induced by IFN-gamma(MIG), IFN-inducible T cell alpha chemoattractant(I-TAC), and IFN-gammainducible protein-10(IP-10)chemokines by human neutrophils［J］. J Immunol, 1999, 162(8):4928-4937．

[7] Antonelli A, Ferrari SM. Chemokine (C-X-C motif) ligand (CXCL)10 in autoimmune diseases［J］. Autoimmun Rev, 2014, 13(3):272-280．

[8] Romagnani P, Crescioli C. CXCL10: a candidate biomarker in transplantation［J］．Clin Chim Acta, 2012, 413(17-18):1364-1373．

[9] Billottet C, Quemener C, Bikfalvi A. CXCR3, a double-edged sword in tumor progression and angiogenesis［J］. Biochim Biophys Acta, 2013, 1836(2):287-295．

[10] Ishiguro N, Takada A, Yoshioka M, et al. Induction of interferoninducible protein-10 and monokine induced by interferon-gamma from human endothelial cells infected with Influenza A virus［J］. Arch Virol, 2004, 149(1):17-34.

[11] Booth V, Keizer DW, Kamphuis MB, et al．The CXCR3 binding chemokine IP-10/CXCL10: structure and receptor interactions［J］. Biochemistry, 2002, 41(33):10418-10425．

[12] 冷紅，張大志．趨化因子IP-10的研究進展［J］. 國際免疫學雜志，2006，29(4):241-244．

[13] Liu D, Cardozo AK, Darville MI, et al. Double-stranded RNA cooperates with interferon-gamma and IL-1 beta to induce both chemokine expression and nuclear factor-kappa B-dependent apoptosis in pancreatic beta-cells: potential mechanisms for viralinduced insulitis and beta-cell death in type 1 diabetes mellitus［J］. Endocrinology, 2002, 143(4):1225-1234.

[14] Cardozo AK, Proost P, Gysemans C, et al. IL-1beta and IFN-gamma induce the expression of diverse chemokines and IL-15 in human and rat pancreatic islet cells, and in islets from pre-diabetic NOD mice［J］. Diabetologia, 2003, 46(2):255-266.

（2016-08-05收稿 2016-12-10修回）

（本文編輯 張云輝）

Research of the expression of interferon inducible protein 10 in patients with hepatogenous diabetes

LIU Xiao-yan, Lü Yong*, WANG Yan-li, ZHU Jin-zhao, CUI Yong-liang, XIONG Wei, WU Xu-wei, HAN Li-fen
Department of Gastroenterology, Mengchao Hepatobiliary Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350025, China
*Corresponding author, E-mail: 364299238@qq.com

ObjectiveTo observe the expression of interferon inducible protein 10(IP-10) in serum and liver tissues of patients with hepatogenous diabetes, and the relationship between IP-10 and the occurrence of hepatogenous diabetes.MethodsELISA, Real-time PCR and immunohistochemistry method were used to test the IP-10 level in serum and liver tissues for 60 hepatic diabetes patients and 60 cases with common liver disease.ResultsThe level of IP-10 in serum of patients with hepatogenous diabetes was (239.542±28.603) pg/ml, which was significantly higher than that in control group(205.341±26.952) pg/ml (P＜0.05). Tested by the method of Real-time PCR, the level of IP-10 in liver tissue of patients with hepatogenous diabetes was significantly higher than that of control group (P＜0.05). Using the method of immunohistochemistry, the IP-10 expression positive rate was 30.0% (18/60) for the hepatogenous diabetes group, which was higher than that of common liver disease group (11.7%, 7/60), (P＜0.05).ConclusionsExpression level of IP-10 protein is high in the serum and liver tissue of patients with hepatogenous diabetes.

interferon inducible protein 10; hepatogenous diabetes; inflammatory cytokines

R587.1

A

1007-8134(2017)01-0038-03

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.01.012

福州市科技計劃項目（2014-S-139-8）

350025 福州，福建醫科大學孟超肝膽醫院消化科（劉曉燕、呂勇、王艷麗、朱金照、崔永良、熊偉、吳旭偉、韓荔芬）

呂勇，E-mail: 364299238@qq.com