菠蘿蜜種子中總黃酮的提取工藝及其抗氧化性研究

張錦東，王小玉，游淑珠，趙國鋒，余以剛

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641；2.珠海出入境檢驗檢疫局技術中心，廣東 珠海 519000；3.珠海市禾協農產品有限公司，廣東 珠海 519100）

菠蘿蜜又稱樹菠蘿、木菠蘿，主要分布于熱帶亞熱帶地區，是常見的熱帶水果。我國種植菠蘿蜜的記載可追溯至1 000多年前，廣泛分布于廣東、海南、云南、四川等地，近年來種植面積和產量日益增長。菠蘿蜜在實際生產中以果肉銷售為主，而生產過程中產生約70%的副產物，如種子、果瓤等鮮少被開發利用，產生的廢棄物造成了環境污染。菠蘿蜜種子在整果中的含量約為12%，菠蘿蜜種子含有豐富的淀粉和蛋白質，其主要組成成分與小麥粉類似；同時菠蘿蜜種子還含有各種礦物質和總黃酮等功能性成分［1-3］，有益氣養血和消炎止痛的功效，營養價值較高。目前，國內外對菠蘿蜜種子的研究利用主要集中在對菠蘿蜜種子的化學組成、淀粉提取工藝及理化性質方面［4-10］，對菠蘿蜜種子中黃酮等功能性成分的相關研究較少，為此，我們采用四因素三水平的正交試驗設計優化了菠蘿蜜種子中總黃酮的提取工藝，并采用DPPH法和水楊酸法測定了總黃酮粗提液的抗氧化性，為菠蘿蜜種子的深加工及綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菠蘿蜜種子由珠海禾協農產品有限公司提供，蘆丁標準品（純度95%）為國藥集團化學試劑有限公司產品。主要試劑：抗壞血酸、二苯代苦味酰基自由基（1，1-pheny-2-picrylhydrazyl，DPPH）、水楊酸、無水乙醇、FeSO4、H2O2、NaNO2、Al(NO2)3、NaOH 等，實驗所用試劑均為分析純。

主要儀器：752S型紫外可見分光光度計（上海棱光技術公司）、JJ200型電子天平（常熟雙杰測試儀器廠）、冷凍干燥機（廣東永利機械設備有限公司）、數顯恒溫水浴鍋（金壇市白塔金昌實驗儀器廠）、DFY-500型搖擺式高速粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）、JW-3021HR型高速冷凍離心機（安徽嘉文儀器設備有限公司）等。

1.2 蘆丁標準曲線的繪制［11-13］

準確稱取0.0100 g蘆丁標準品，置于50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液經超聲波溶解后定容至刻度，即配制成0.2 g/L的標準溶液。分別準確移取標準溶液0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL（相當于 0.00、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mg無水蘆丁）于6支25 mL容量瓶中，分別加入蒸餾水至約10.0 mL。依次加入配置好的7.25×10-1mol/L的NaNO2溶液1.0 mL，搖勻并靜置6 min；依次加入配置好的1.59 mol/L Al（NO3）3溶液 1.0 mL，搖勻并靜置 6 min；依次加入配置好的5 mol/L NaOH溶液4.0 mL，分別用蒸餾水定容至刻度，搖勻并靜置15 min。以試劑空白調節零點，在λ= 510 nm處測定吸光度值A。每個處理3次重復。

1.3 總黃酮提取工藝的優化

1.3.1 單因素實驗設計 （1）樣品預處理：菠蘿蜜種子經真空冷凍干燥處理后，用粉碎機粉碎成粉末，過孔徑0.250 mm篩，裝入錫箔袋密封避光保存。

（2）總黃酮粗提液的配制：準確稱取一定質量的菠蘿蜜種子粉樣品，在文獻［14-17］的基礎上，以乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間作為實驗設計參數，以乙醇溶液為溶劑，把樣品加入一定量溶劑中，加熱提取、抽濾，4 000 r/min離心15 min，取上清液；將濾渣按上述方法處理1次，抽濾、離心，合并提取液，將所得到的提取液定容于50 mL容量瓶中；從上述50 mL溶液中準確移取5.0 mL置于比色皿中，加入7.25×10-1mol/L的NaNO2溶液1.0 mL，搖勻并靜置6 min；加入1.59 mol/L的Al（NO3）3溶液1.0 mL，搖勻并靜置6 min；加入5 mol/L的NaOH溶液4.0 mL，搖勻并加入0.4 mL蒸餾水，搖勻并靜置15 min，在510 nm處測其吸光度值A。根據線性回歸方程y = 0.4174x + 0.0001，計算菠蘿蜜種子中總黃酮含量。菠蘿蜜種子中總黃酮提取率計算公式為：

（3）乙醇濃度的確定：固定提取時間40 min、提取溫度60℃、料液比1∶5 g/mL，選擇乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%分別提取菠蘿蜜種子中黃酮化合物。

（4）料液比的確定：固定乙醇濃度60%、提取時間40 min、提取溫度60℃，選擇料液比為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL 分別提取菠蘿蜜種子中黃酮化合物。

（5）提取溫度的確定：固定乙醇濃度60%、提取時間40 min、料液比1∶15 g/mL，選擇提取溫度為40、50、60、70、80℃分別提取菠蘿蜜種子中黃酮化合物。

（6）提取時間的確定：固定乙醇濃度60%、提取溫度70℃、料液比1∶15 g/mL，選擇提取時間為30、40、50、60、70 min分別提取菠蘿蜜種子中黃酮化合物。

1.3.2 正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，根據組合試驗設計原理，對乙醇濃度（A）、提取溫度（B）、料液比（C）、提取時間（D）4個變化因素，采用L9（34）即四因素三水平的分析方法，分析4種因素對菠蘿蜜種子中總黃酮提取率的影響。根據單因素試驗結果，確定正交試驗因素水平（表1）。

表1 正交試驗因素水平

1.4 總黃酮抗氧化活性的測定

1.4.1 DPPH法 DPPH法可以快速、簡便、靈敏地檢測出天然抗氧化劑的抗氧化活性。其氧化活性用清除率來表示，清除率越大，抗氧化性越強。在文獻［18-22］的基礎上，按如下測定步驟操作：（1）取0.25 mL 1.26×10-4mol/L的DPPH溶液與1.0 mL無水乙醇混合并搖勻，在37℃下靜置30 min，以無水乙醇為空白在517 nm波長處測定其吸光度值，記為A0。（2）分別取1 mL提取液與0.25 mL無水乙醇混合并搖勻，在37℃下靜置30 min，以無水乙醇為空白在517 nm測定其吸光度值，記為Aj。（3）分別取1 mL提取液與0.25 mL 1.26×10-4mol/L的DPPH溶液混合并搖勻，在37℃下靜置30 min，以無水乙醇為空白在517 nm測定其吸光度值，記為Ai。計算總黃酮提取液對DPPH的清除率：

式中，A0為樣品空白在517 nm波長下測得的吸光度值，Aj為提取液不加DPPH時在517 nm波長下測得的吸光度值，Ai為提取液加DPPH后在517 nm波長下測得的吸光度值。

以同樣方法測定Vc對DPPH的清除能力，作為對照。3次重復。

1.4.2 水楊酸法 Fenton反應會產生羥自由基（·OH），水楊酸與羥自由基反應產生2，3-二羥基苯甲酸，該物質在510 nm處的吸光值與·OH的含量成正比。因此可通過紫外分光光度法測定·OH的含量并描述待測物質對·OH的清除能力。在文獻 ［23-27］的基礎上，按如下測定步驟操作：（1）取1.0 mL 9.0×10-3mol/L的FeSO4溶液與1.0 mL 9.0×10-3mol/L的水楊酸、1.0 mL 8.8×10-3mol/L的 H2O2、1.0 mL蒸餾水混合并搖勻，在37℃下靜置1 h，以蒸餾水為空白在510 nm波長處測定其吸光度值，記為A0。（2）取 1.0 mL 9.0×10-3mol/L 的 FeSO4溶液與1.0 mL 9.0×10-3mol/L的水楊酸、1.0 mL 8.8×10-3mol/L的H2O2、1.0 mL粗提液混合并搖勻，在37℃下靜置1 h，以蒸餾水為空白在510 nm波長處測定其吸光度值，記為Ai。（3）取1.0 mL 9.0×10-3mol/L的FeSO4溶液與1.0 mL 9.0×10-3mol/L的水楊酸、1.0 mL粗提液、1.0 mL蒸餾水混合并搖勻，在37℃下靜置1 h，以蒸餾水為空白在510 nm波長處測定其吸光度值，記為Aj。計算總黃酮粗提取液對·OH的清除率：

式中，A0為樣品空白在510 nm波長下測得的吸光度值，Ai為粗提液加H2O2后在510 nm波長下測得的吸光度值，Aj為粗提液不加H2O2時在510 nm波長下測得的吸光度值。

試驗數據通過Excel處理，以鄧肯新復極差檢驗法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 總黃酮的檢測

以吸光度值A為縱坐標，蘆丁含量為橫坐標，繪制標準曲線，蘆丁標準曲線見圖1。通過線性擬合得到回歸方程y = 0.4174x + 0.0001，相關系數R2= 0.9993。根據樣品吸光度值和標準曲線計算樣品中總黃酮含量，結果表明，黃酮含量在0～2.0mg范圍內線性關系良好。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 總黃酮的提取工藝

2.2.1 單因素試驗結果及分析 （1）乙醇濃度對總黃酮提取率的影響：由圖2可知，當乙醇濃度低于60%時，隨著乙醇濃度的提高，總黃酮含量增加趨勢顯著，總黃酮提取率遞增，其中，乙醇濃度60%時的總黃酮提取率為1.82%，比乙醇濃度40%時高了75.7%；當乙醇濃度高于60%時，總黃酮提取率遞增速率明顯降低，乙醇濃度80%時的總黃酮提取率只比60%時高3.3%，說明此時菠蘿蜜種子中總黃酮提取已經較充分。考慮綜合成本等實際因數，選取60%為合適的乙醇濃度。

圖2 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

（2）料液比對總黃酮提取率的影響：由圖3可知，隨著料液比的降低，總黃酮提取量逐漸遞減；當料液比高于1∶15 g/mL時，總黃酮提取率隨料液比的降低而逐漸遞增，料液比為1∶15 g/mL時總黃酮提取率達到峰值2.73%，比1∶5 g/mL時高了50.0%；當料液比小于1∶15 g/mL時，總黃酮提取率隨料液比的降低而無明顯變化。因此當料液比為1∶15 g/mL時，認為總黃酮的提取已經比較充分。綜上所述，選取1∶15 g/mL為提取的合適料液比。

圖3 料液比對黃酮提取率的影響

（3）提取溫度對總黃酮提取率的影響：由圖4可知，當提取溫度在40～70℃時，隨著提取溫度的提高，總黃酮含量逐漸遞增，總黃酮提取率也隨之逐漸遞增，提取溫度在70℃時出現峰值2.84%，其中提取溫度為70℃時的總黃酮提取率比40℃時提高了78.6%。當提取溫度超過70℃時總黃酮提取量與提取率均呈現遞減趨勢，提取溫度為80℃時的總黃酮提取率比70℃時降低了6.4%，說明溫度過高破壞了黃酮的提取體系，不利于提取。綜上所述，選取70℃為合適的提取溫度。

圖4 提取溫度對黃酮提取率的影響

圖5 提取時間對黃酮提取率的影響

表2 正交試驗結果

（4）提取時間對總黃酮提取率的影響：由圖5可知，當提取時間在30～50 min時，隨著提取時間的延長，總黃酮含量逐漸遞增，總黃酮提取率也隨之逐漸遞增，提取時間在50 min時出現總黃酮提取率峰值（2.89%），其中提取時間為50 min時的總黃酮提取率比30 min時提高了16.7%。當提取溫度超過50 min時總黃酮提取量與提取率均呈現遞減趨勢，提取溫度為70 min時的總黃酮提取率比50 min時降低了5.9%，表明提取時間過長不利于總黃酮的提取，這可能是由于在高溫下提取時間過長對部分黃酮造成了影響所致。綜上所述，選取50 min為提取的合適時間。

2.2.2 正交試驗結果及分析 由表2可知，在水浴提取條件下，乙醇濃度為極顯著影響因素，提取溫度、料液比、提取時間為顯著因素，從實際生產情況考慮，最終確定生產的最優工藝為A3B1C3D2，即70%乙醇、60℃水浴提取50 min、料液比為1∶20。最優條件下，菠蘿蜜種子中總黃酮提取率達到3.30%。

2.3 總黃酮粗提液的抗氧化活性

2.3.1 DPPH法 從圖6可以看出，菠蘿蜜種子中總黃酮提取液和Vc溶液對DPPH的清除能力均隨濃度的提高而增強，在濃度小于0.1 mg/mL時，總黃酮提取液對DPPH的清除能力強于Vc，當濃度大于0.10 mg/mL后，Vc對DPPH的清除能力稍強。菠蘿蜜種子中總黃酮提取液的IC50＞Vc的IC50值，表明低濃度下菠蘿蜜種子中總黃酮提取液的對DPPH的清除能力較強，抗氧化活性較強。

圖6 不同濃度下反應液對DPPH的清除率

2.3.2 水楊酸法 從圖7可以看出，隨濃度的提高，總黃酮粗提液和Vc溶液對·OH的清除能力逐漸增強，在濃度小于0.38 mg/mL時，總黃酮提取液對DPPH的清除能力強于Vc，黃酮提取液的IC50＞Vc的IC50。當濃度大于0.380 mg/mL后，Vc對·OH的清除能力稍強。在最優提取工藝條件下，濃度為0.6 mg/mL的菠蘿蜜種子中總黃酮粗提液對·OH清除達到95.3%，表明其總黃酮粗提液對·OH有較高的清除能力，具有較高的開發利用價值。

圖7 不同濃度下反應液對·OH的清除率

3 結論與討論

（1）在水浴條件下，4個因素對菠蘿蜜種子粉總黃酮提取率的影響大小為：乙醇濃度＞料液比＞提取溫度＞提取時間。其中，乙醇濃度對總黃酮提取率影響極顯著，料液比、提取溫度、提取時間對總黃酮提取率影響顯著；菠蘿蜜種子中總黃酮的提取最優工藝為乙醇體積分數70%，料液比1：20 g/mL，60℃水浴提取50 min，提取率達到3.30%。

（2）菠蘿蜜種子中總黃酮粗提液對DPPH及·OH的清除能力隨濃度的提高而增強，濃度在0.3 mg/mL時對DPPH及·OH的清除率分別達到90.2%和94.1%，說明菠蘿蜜種子中的總黃酮具有較強的抗氧化能力，可作為天然健康食品原料。

（3）菠蘿蜜品種眾多，按肉質和水分含量可分為干苞和濕苞兩種類型；按花期可分為單造和雙造兩種類型等。由于各品種營養品質差異較大，且各營養成分間的相關性尚有待研究，本試驗未對多品種菠蘿蜜種子的提取工藝及抗氧化性作進一步分析，因此仍需進一步研究完善。

［1］尹道娟，張國治，薛慧，等. 菠蘿蜜種子粉主要化學成分和加工性能研究［J］. 河南工業大學學報（自然科學版），2014（1）：87-91.

［2］張濤，潘永貴. 菠蘿蜜營養成分及藥理作用研究進展［J］. 廣東農業科學，2013，40（4）：88-90，103.

［3］S B Swami，N J Thakor，P M Haldankar，et al.Jackfruit and its many functional components as related to human health［J］. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2012，11 （6）：565-576.

［4］胡美杰. 菠蘿蜜種子淀粉提取工藝、物化特性及其在餅干中的應用［D］. 哈爾濱：黑龍江東方學院，2016.

［5］楊慧強，白新鵬，呂曉亞，等. 菠蘿蜜種子淀粉提取工藝及其物性的研究［J］. 食品科技，2016（3）：237-242.

［6］初眾，胡美杰，徐飛，等. 響應面法優化酶法提取菠蘿蜜種子淀粉工藝［J］. 食品工業科技，2016，37（20）：189-193，200.

［7］張彥軍，朱紅梅，田建文，等. 菠蘿蜜種子淀粉制備香草蘭微膠囊的工藝研究［J］. 熱帶作物學報，2017（6）：1127-1133.

［8］Fateatun N，Md J R，Md S M，et al. Physicochemical Properties of Flour and Extraction of Starch from Jackfruit Seed［J］. International Journal of Nutrition and Food Sciences，2014，4（3）：347-354.

［9］P L Tran，D H D Nguyen，V H Do，et al.Physicochemical properties of native and partially gelatinized high-amylose jackfruit（Artocarpusheterophyllus Lam.）seed starch［J］. LWT-Food Science and Technology，2015，62 （2）：1091-1098.

［10］K Rengsutthi，S Charoenrein. Physicochemical properties of jackfruit seed starch（Artocarpusheterophyllus）and its application as a thickener and stabilizer in chilli sauce［J］.LWT-Food Science and Technology，2011，44（5）：1309-1313.

［11］河北省技術監督局. DB13/T 385-1998. 食品中總黃酮（蘆丁）的測定［S］. 1998.

［12］湖南省技術監督局. DB43/T 476-2009. 植物源性食品中總黃酮的測定［S］. 2009.

［13］全國果品標準化技術委員會. NY/T27 41-2015.仁果類水果中類黃酮的測定［S］. 2015.

［14］江新德，江桂仙，邱深玉，等. 菠蘿蜜葉中水溶性黃酮的分離與純化［J］. 南昌工程學院學報，2015（4）：11-14，25.

［15］郝倩. 菠蘿蜜葉黃酮類化合物的提取及其浸膏的應用［D］. 北京：北京林業大學，2014.

［16］李絢，龍敏儀. 紫外分光光度法測定食用玫瑰花中類黃酮的含量［J］. 食品研究與開發，2015（23）：142-144.

［17］鄧夢琴. 菠蘿蜜果皮總黃酮的提取、分離純化、結構鑒定及其抗氧化活性研究［D］. 廣州：華南農業大學，2016.

［18］韋獻雅，殷麗琴，鐘成，等. DPPH法評價抗氧化活性研究進展［J］. 食品科學，2014（9）：317-322.

［19］袁園，張瀟，陳碧瓊，等. 草果總黃酮的提取及DPPH自由基清除活性研究［J］. 食品研究與開發，2017（15）：63-68.

［20］姚文紅，李飛陽，王娟，等. 女貞花總黃酮提取及清除DPPH自由基作用的研究［J］. 食品研究與開發，2016（14）：42-45，67.

［21］林戀竹，趙謀明. 反應時間對DPPH·法、ABTS+·法評價抗氧化性結果的影響［J］. 食品科學，2010（5）：63-67.

［22］韋獻雅，殷麗琴，鐘成，等. DPPH法評價抗氧化活性研究進展［J］. 食品科學，2014（9）：317-322.

［23］李艷，鞏士磊，車影，等. Fenton反應考察抗壞血酸清除羥基自由基能力及動力學［J］. 應用化學，2015（8）：948-954.

［24］代沙. 紫蘇葉抗氧化物質提取、含量測定及抗氧化活性研究［D］. 雅安：四川農業大學，2013.

［25］文紅波，曹運長，吳玉蘭，等. 金櫻子總黃酮體外抗氧化活性的研究［J］. 天然產物研究與開發，2014（7）：1127-1131.

［26］李粉玲，蔡漢權，林澤平. 紅豆多糖抗氧化性及還原能力的研究［J］. 食品工業，2014（2）：190-194.

［27］Maja M P，Anton L，Valentina S，et al. Extraction methods，Comparison of major taste compounds and antioxidative properties of fruits and flowers of different Sambucus species and interspecific hybrids［J］. Food Chemistry，2016，200：134-140.