兩株耐高溫酵母菌的鑒定及其特性研究

宋培勇，曾伯平，肖仲久

（遵義師范學院生物與農業科技學院，貴州 遵義 563000）

隨著石油資源的日漸枯竭，尋找并開發可再生能源是人類的必然選擇。可再生能源包括太陽能、水能、潮汐能、風能和生物質能等。乙醇就是一種生物質能，用途廣泛，可用作燃料、飲料、化工原料、溶劑和消毒劑等。作為車用燃料的乙醇汽油在減少CO、HC、NOx、顆粒物和苯系物等有毒物質排放方面具有顯著功效，可以減少環境污染物的排放，顯著改善空氣質量［1］。 酵母菌利用EMP途徑進行同型乙醇發酵，而細菌利用ED途徑進行同型乙醇發酵。酵母菌由于其卓越的發酵性能和耐受高溫以及在預處理和發酵過程中產生副產物的能力，用作乙醇生產比細菌更有效［2］。有多種原料可以用作乙醇生產的潛在底物，如甘蔗、糖用甜菜、甜高粱、乳清和糖蜜等糖類，玉米、小麥、木薯和馬鈴薯等淀粉類，柴草、農作物秸稈和殘茬等木質纖維素類［2］。纖維素是地球上含量最豐富的可再生資源［3］，用木質纖維素類物質通過微生物乙醇發酵生產燃料乙醇是解決當今能源短缺的理想途徑，而在各種乙醇發酵方法中，最具發展潛力和優勢的方法之一就是同步糖化發酵法（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）。同步糖化發酵法這一概念最早是由Gauss等［4］于1976年提出的，所謂同步糖化發酵就是纖維素的酶解（即糖化）和乙醇發酵在同一裝置內同步進行。同步糖化發酵法工藝流程短、設備投資少、乙醇產量高、生產成本低。但是SSF法也存在致命缺點，即酶水解的最適溫度（55℃）和發酵溫度（30℃）不一致。為此，人們把目光投向了耐高溫酵母菌。耐高溫酵母是高溫條件下成功生產乙醇的關鍵因素，高溫發酵生產乙醇具有冷卻成本低、污染風險小、節約糖化酶的使用等多種優點［5］。選育耐高溫酵母可以采取高溫馴化［6-8］、雜交育種、誘變育種、原生質體融合［9］和基因工程等技術措施。從高溫自然環境中篩選耐高溫酵母，雖然工作量較大，但篩選獲得的酵母遺傳性狀穩定，仍不失為一種可行、可靠和可取的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土樣：試驗土樣從貴州茅臺酒廠附近常年堆放酒糟的地段采集。

培養基：YEPD培養基［10］、胡蘿卜塊培養基［11］，PDA培養基、McClary培養基、蛋白胨水培養基、硝酸鹽還原培養基、碳源同化基礎培養基、氮源同化基礎培養基［12-13］、種子培養基［14］，EFM 培養基［15］，均參考相關文獻進行配制。

主要儀器設備：PCR擴增儀S1000TM Thermal Cycler（Bio-Rad），WD-9413A凝膠成像分析儀、DYY-10C型電泳儀（北京六一），GC7890型氣相色譜儀（美國安捷倫），T6紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器公司）。

主要藥品及試劑：PCR引物NL-1：5′-GC ATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′、NL- 4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG- 3′（上海生工生物技術有限公司合成），200 bp DNA Ladder（北京天根生化科技）； PCR試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌的分離 稱取土樣，用無菌水進行梯度稀釋制成10-3、10-4的土壤懸液，然后采取無菌操作技術吸取0.1 mL涂布于PDA平板上，每個稀釋度接2個平板，于28～30℃培養，待長出菌落后，挑取單菌落劃線轉接于PDA平板，連續2 次，以獲得純培養，斜面保存備用。

1.2.2 高溫酵母的篩選 從PDA斜面挑取酵母菌純培養物轉接到YEPD平板上，分別在37、40、 41、42、43、44、45、46、47℃下培養 48 h，觀察其生長狀況。通過菌落形態、細胞形態、產生子囊孢子和擲孢子與否及是否形成假菌絲等進行形態學及生理鑒定鑒定。

1.2.3 生化特征測試 進行硝酸鹽還原試驗、糖發酵試驗、碳源同化試驗、氮源同化試驗、產類淀粉化合物測定。

1.2.4 PCR擴增 酵母菌基因組DNA模板按文獻［16］方法準備并略作改動：從長出酵母菌菌落且經4℃過夜的YEPD平板上挑取菌落，懸浮在100 μL滅菌去離子水中，放超低溫冰箱（-75℃）中凍透，然后取出放沸水中煮10 min，放-20℃保存備用。26S rDNA D1/D2區序列PCR擴增引物為NL-1、NL-4［17］，擴增程序為：94℃ 3 min；94℃ 40 s，48℃ 45 s，72℃ 45 s，5 個循環；94℃ 40 s，53℃ 45 s，72℃ 45 s，25 個循環；72℃ 8 min［18］。擴增結果用1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 測序及Blast比對分析 PCR擴增產物交上海生工生物技術有限公司測序，將測序結果登錄NCBI進行Blast比對。

1.2.6 耐性測試 （1）耐糖性：制備初始糖濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%的培養基，無菌操作接種耐高溫酵母，45℃培養24 h，在OD660下測其生物量。

（2）耐酸性：制備初始pH分別為2、2.5、3、3.5、4、4.5、5的種子培養基，無菌操作接種耐高溫酵母，45℃培養24 h，在OD660下測其生物量。

（3）耐乙醇性：制備初始乙醇體積分數分別為6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%的種子培養基，無菌操作接種耐高溫酵母，45℃培養24 h，在OD660下測其生物量。

1.2.7 產乙醇能力測試 乙醇發酵參照文獻［15］介紹的方法并略作改動：將YEPD斜面上活化的酵母菌株接種于2 mL YEPD液體培養基中，分別在30℃和45℃、120 r/min條件下培養16 h，轉接到10 mL YEPD液體培養基中在30℃和45℃、120 r/min條件下培養18 h，再轉接到100 mL EFM培養基中在30℃和45℃、120 r/min條件下培養6 h，然后進行厭氧發酵，72 h后取樣，用氣相色譜法測定發酵液的乙醇含量。

2 結果與分析

2.1 耐高溫酵母菌分離篩選

從供試土樣中共分離得到12株酵母菌，經48 h耐高溫培養篩選，得到2株能耐45℃以上高溫的酵母菌，分別編號為Y1、Y2，在45℃時能正常生長，且Y1的長勢比Y2稍好。但在46、47℃溫度條件下兩菌株長勢弱、菌落小。

2.2 耐高溫酵母菌的形態及生理特征

菌株Y1、Y2在PDA平板上菌落大而突起，濕潤，圓形或橢圓形，表面光滑，無皺褶，邊緣整齊，乳白色；菌體細胞呈圓形或卵圓形，單邊芽殖或多邊芽殖。在產孢培養基上培養7～15 d，結果在麥氏培養基上兩菌株均未見子囊孢子形成，而在胡蘿卜塊培養基上卻能形成子囊孢子；經倒置培養觀察，兩菌株均不見產生擲孢子；在PDA平板上劃線蓋玻片壓片培養，顯微鏡觀察，Y1、Y2均能形成藕節狀假菌絲。

2.3 耐高溫酵母菌生化特征

糖發酵及碳源同化試驗表明，在9種供試糖或碳源中，除甘露糖外，在其余8種碳源上的Y1、Y2均表現一致（表1）；氮源利用試驗表明，在5種供試氮源中，Y1、Y2均可生長，只是在以KNO3為氮源時生長弱（表2）；硝酸鹽還原試驗測試，Y1、Y2均為陰性；產類淀粉化合物測定，菌落周圍均未呈現出藍色，結果為陰性；產酸試驗，菌落周圍的碳酸鈣未溶解，說明無酸產生。

表1 糖發酵及碳源同化結果

表2 氮源同化結果

2.4 26S rDNA D1/D2區PCR擴增及測序比對分析

用26S rDNA D1/D2區PCR擴增引物NL-1和NL-4［17］，擴增到約600 bp大小的DNA條帶（圖 1），與付俊淑等［18］、馬凱等［19］、張曉娟等［20］、趙麗麗等［21］的報道基本一致。據劉寧等［22］報道，26S rDNA 的 D1/D2 區域位于大亞基的 5′端，序列長度在600 bp左右，說明本試驗已成功擴增到了目的條帶。

圖1 酵母菌26S rDNA D1/D2 區PCR 擴增結果

將PCR擴增產物交上海生工生物技術有限公司測序，Y1和Y2均獲得預期結果，登錄NCBI輸入測序結果進行Blast比對，結果見表3。

表3 26S rDNA D1/D2區PCR擴增產物BLAST比對結果

利用Y1、Y2及其最高相似性菌株序列，并以Saccharomyces cerevisiae strain NL18（與Y1和Y2的相似性均為77%）作為參比菌株，用MEGA4.0中的鄰接法（重復值1 000）構建出系統發育樹（圖2），結果顯示，Y1、Y2及其最相似性菌株聚為一支，而Saccharomyces cerevisiae strain NL18 單獨一支。Kurtzman 等［17］對子囊菌綱近500種酵母菌的26S rDNAD1/D2區序列進行了測定，認為種內序列變異≤1%，而種間序列差異＞1%。據此，Y1和Y2可分別歸類為東方伊薩酵母和庫德畢赤酵母。

圖2 根據酵母菌26S rDNA D1/D2區序列構建的系統發育樹

2.5 高溫酵母耐性測試

2.5.1 耐糖性 在初始糖濃度范圍內，其糖濃度越高，OD660值就越大，但當糖濃度達到并高于25%時出現抑制（表4），表明其耐糖性為25%，較劉暢等［23］報道的耐糖性（10%）高。

表4 初始糖濃度對酵母菌Y1、Y2生長（OD660值）的影響

2.5.2 耐酸性 耐酸性測試結果（表5）顯示，Y1和Y2菌株的最適pH=4，較劉暢等［23］的報道（pH 5.5）低。

2.5.3 耐乙醇性 在測試濃度下，Y1和Y2都隨初始乙醇濃度的升高，其OD值逐漸降低，Y1在8%及以上濃度時出現抑制作用，Y2在10%及以上出現抑制作用（表6），低于Atiya Techaparin等［2］報道的5株酵母菌（釀酒酵母KKU-VN8、KKU-VN20、KKU-VN27和庫德畢赤酵母KKU-TH33、KKU-TH43）13%的乙醇耐受水平。

表5 初始pH對酵母菌Y1、Y2生長（OD660值）的影響

表6 初始乙醇濃度對酵母菌Y1、Y2生長（OD660值）的影響

2.5.4 產乙醇性能 酵母菌Y1、Y2在不同溫度條件下發酵72 h后的乙醇產量（V/V）存在差異，在30℃下乙醇產量分別為3.8%、8.7%，45℃下分別為5.1%、9.8%，均高于30℃；Y2在兩種溫度條件下的乙醇產量均高于Y1，亦均高于劉超帝等［5］報道的耐高溫能力和乙醇發酵能力最強的馬克斯克魯維酵母（40℃、72 h，6.56%）。

3 結論與討論

本試驗經分離、篩選得到2株耐高溫酵母菌Y1和Y2，經形態學、生理生化、分子鑒定及系統發育分析，初步鑒定Y1為東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis），Y2為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。Y1和Y2在45℃時均能正常生長，在46、47℃時能微弱生長，但其長勢明顯變弱，菌落形態也有明顯變化。就高溫下的長勢而言，Y1稍優于Y2，說明Y1比Y2對高溫的耐受性能略強。耐性測試結果表明，初始糖濃度對兩株酵母菌的影響相差不大，在25%時出現抑制現象；初始乙醇濃度達8%時Y1出現抑制，初始乙醇濃度達10 % 時Y2出現抑制，說明Y2比Y1對乙醇的耐受性要好；Y1、Y2的最適pH均為4；Y1、Y2在45℃下的乙醇產量高于30℃，且Y2在兩種溫度條件下的乙醇產量均高于Y1。說明Y1、Y2可能具有潛在的利用價值，尤其是Y2有較好的乙醇發酵性能，通過誘變或原生質體融合等技術提高其耐乙醇能力，可望獲得用于同步糖化乙醇發酵的優良菌株。

耐高溫酵母一般從酒醅、腐爛的水果、熱帶溫泉土等環境樣品中篩選［23-25］。從酒糟堆放地土樣中篩選耐高溫酵母尚未見報道。常年堆放酒糟的土壤由于溫度較高，酒糟中的一些微生物如酵母菌等可進入土壤中。本試驗結果表明，從酒糟堆放地土壤分離的酵母菌中篩選耐高溫酵母是可行的。

傳統權威的酵母菌鑒定方法是依據形態學及生理生化特征，可將待檢菌株分類到屬和種［26］。隨著分子生物學的發展和一系列核酸數據庫的建立，通過核糖體RNA基因序列比對鑒定微生物菌種越來越盛行。鑒定酵母菌常用核糖體大亞基26S rRNA的D1/D2基因序列，該序列位于5′端。研究表明，26S rRNA的Dl/D2區域具有較高的變異率，同種不同菌株的堿基差異一般不超過1%［27］，而屬于不同種的菌株其核苷酸序列差異一般較大，根據這一標準，可以將絕大部分酵母鑒定到種。因此很多酵母菌的鑒定多用此分析方法［28-29］。該方法以通用引物擴增26S rRNA D1/D2區基因并測序，然后利用核酸序列數據庫進行Blast比對分析就可以對酵母菌進行鑒定，其分辨率高于18S rRNA基因序列。該區域基因序列對未知菌種的快速鑒定和系統發育樹的構建具有很大優勢。我們根據26S rDNA D1/D2 區序列比對和系統發育分析，并結合其形態學和生理生化特征，鑒定菌株Y1為東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis），Y2鑒定為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。

耐性試驗表明，當初始糖濃度達25%時分離菌株出現生長抑制，因此在進行乙醇發酵性能測試時我們選擇含糖20%的發酵培養基；菌株生長的最適pH值為4，比徐大鵬等［14］、劉暢等［23］報道的低；當初始乙醇濃度達8%時Y1出現抑制，10%時Y2出現抑制，均比劉暢等［23］報道的低，但均比徐大鵬等［14］報道的高。酵母菌發酵過程產生的乙醇，當達到一定濃度時，抑制其生長發育并影響乙醇產率［30］，因此對乙醇的耐受能力也是篩選乙醇高產菌株的前提條件之一。乙醇發酵試驗表明兩菌株在45℃條件下的乙醇產量都比30℃高，說明高溫有利于乙醇發酵，尤其是Y2的乙醇發酵性能更勝一籌。這是耐高溫酵母可用于同步糖化發酵的潛在優勢。

據孫劍秋等［31］報道，東方伊薩酵母、庫德畢赤酵母和釀酒酵母可能在白酒釀造過程中發揮更重要的作用。劉婷婷［32］通過研究發現，東方伊薩酵母是兼香型白酒白云邊酒發酵堆積料和出池酒醅中的優勢菌，而庫德畢赤酵母是香型獨特的衡水老白干大曲中特有的重要功能菌之一。本試驗從茅臺酒酒糟堆放地土壤中分離到東方伊薩酵母和庫德畢赤酵母，說明東方伊薩酵母和庫德畢赤酵母在多種香型白酒釀造和風味成型過程中可能都起一定作用。

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