金線蓮總黃酮的最佳超聲提取工藝

王澄林，張勛，陳抒云，黃澤豪，朱志靈，林羽（.福建中醫藥大學藥學院，福建福州350；.福建中醫藥大學，福建福州350）

金線蓮總黃酮的最佳超聲提取工藝

王澄林1，張勛1，陳抒云1，黃澤豪1，朱志靈1，林羽2
（1.福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122；2.福建中醫藥大學，福建福州350122）

目的優化金線蓮總黃酮的超聲提取工藝。方法用紫外-可見分光光度比色法測定黃酮含量，用L9（34）正交試驗，考察乙醇濃度、料液比、提取時間、提取次數對金線蓮總黃酮含量測定的影響。結果最優的提取工藝為40倍量的95%乙醇超聲提取3次，每次40 min，金線蓮的總黃酮提取率為2.06%。結論乙醇濃度對總黃酮的提取率有顯著影響，經優化的提取工藝，操作簡單，提取效率較高，方法穩定、可行。

金線蓮；總黃酮；超聲提取；最佳工藝；正交設計

我們用正交試驗法，以金線蓮總黃酮含量為指標，超聲提取為方法，考察不同因素對金線蓮總黃酮含量測定的影響，以確定其最佳提取工藝。

1 材料與儀器

1.1 藥材金線蓮樣品由福建虎伯寮生物集團有限公司提供，3個月全株苗，經福建中醫藥大學藥學院黃澤豪副教授鑒定為蘭科開唇蘭屬的福建金線蓮Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.。

1.2 試劑蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：10080—200707）；亞硝酸鈉（上海聯試化工試劑有限公司）；硝酸鋁（上海展云化工有限公司，批號：0909179）；氫氧化鈉、甲醇、乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20080605、20150209、20150126）；超純水（實驗室自制），試劑均為分析級。

1.3 儀器CP214型分析天平（美國奧豪斯儀器上海有限公司）；KQ—500DE超聲提取儀（昆山市超聲儀器有限公司）；DLSB—5／20低溫冷卻循環泵、SHB—III循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；RE—2000A旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；TDL80—2B離心機（上海安亭科學儀器廠）；UV—9100紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）。

2 方法

2.1 標準溶液的配制稱取蘆丁對照品5 mg置于25 mL瓶中，加15 mL甲醇超聲溶解后定容至刻度，即得標準溶液。

2.2 供試品溶液的制備稱取干燥、粉碎過60目篩的金線蓮粉末0.5 g置于25 mL具塞三角燒瓶中，按L9（34）正交設計，加入20 mL 95%乙醇浸泡過夜，超聲提取功率為300 W。3 000 r／min離心15 min，過濾，提取3次，每次40 min，合并濾液，45℃真空減壓濃縮至干，加適量甲醇使溶解并轉移至100 mL瓶中，既得。

2.3 金線蓮總黃酮含量測定吸取供試品溶液5 mL置25 mL瓶中，加1 mL 5%亞硝酸鈉，搖勻，放置6 min，再加1 mL 10%硝酸鋁，搖勻，放置6 min，最后加10 mL 4%NaOH溶液，混勻，甲醇定容，放置15 min。以不加蘆丁對照品的試劑為空白對照，在最大吸收波長501 nm處測定吸光度值，計算總黃酮的提取率。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察取蘆丁標準品溶液0、1、2、3、4、5、6 mL分別置于25 mL瓶中，配制不同濃度標準品溶液，按2.3項方法測定吸光度值。

2.4.2 精密度考察40倍量的95%乙醇超聲提取3次，每次40 min，提取金線蓮總黃酮，得樣品溶液。在相同條件下平行測定5次吸光度值，計算RSD。

2.4.3 穩定性考察將2.4.2項的樣品溶液每隔10 min測定1次吸光度值，連測5次，計算RSD。

2.4.4 加樣回收率試驗取5個25 mL瓶，分別加入5 mL已知含量的樣品溶液和2.5 mL濃度為0.2 mg／mL的蘆丁標準品溶液，按照2.3項方法測定吸光度值，平行測3次，計算總黃酮含量，得平均回收率和RSD。

2.5 正交實驗設計試驗考察了提取方法（回流提取和超聲提取）、提取溶劑（甲醇和乙醇）、浸泡時間（6、12、18、24 h）以及溶劑濃度、料液比、提取時間、提取次數，確定了這4個主要因素，同時對4個主要因素進行水平篩選，確定了3個水平，因素與水平設計見表1。

3 結果與分析

3.1 最大吸收峰見圖1。光譜掃描結果表明在501 nm處有最大吸收峰。

3.2 標準曲線及回歸方程以吸光度（A）為縱坐標，濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：

表1 正交試驗因素水平表

圖1 光譜掃描曲線

結果表明蘆丁濃度在0.008～0.048 mg／mL，吸光度值與濃度呈良好的線性關系。

3.3 精密度考察5次測定的吸光度值為0.251、0.251、0.252、0.251、0.253，計算得吸光度的RSD為0.35%，表明精密度良好。

3.4 穩定性考察每隔10 min測定的吸光度值為0.252、0.252、0.250、0.249、0.249，計算得吸光度的RSD為0.52%，表明樣品溶液在1 h內具有良好的穩定性。

3.5 加樣回收率見表2。

表2 加樣回收率試驗（n＝3）

結果表明平均加樣回收率為101.04%，RSD為4.5%。

3.6 正交試驗結果見表3、表4。

表3結果表明，A項極差最大，C項極差最小，即4個因素對金線蓮總黃酮提取率的影響程度為：A＞D＞B＞C。結果表明，乙醇濃度對金線蓮總黃酮提取率影響最大，提取次數次之，提取時間影響最小。

表3 L9（34）正交試驗結果

表4 方差分析

表4結果表明，乙醇濃度對金線蓮總黃酮提取率有顯著影響，其它3個因素無顯著性影響。綜合極差和方差分析的結果，提取金線蓮總黃酮的最佳工藝條件為A1B3C1D3，即40倍量的95%乙醇超聲提取3次，每次40 min。

3.7 驗證試驗為驗證該工藝的穩定性和合理性，以最佳提取工藝條件進行驗證試驗，結果見表5。

表5 驗證試驗結果

表5結果表明，金線蓮總黃酮提取率平均值為2.06%，RSD為1.45%，此結果表明該提取工藝條件穩定可行。

4 討論

本實驗通過L9（34）正交試驗，最終確定金線蓮總黃酮的最佳提取工藝為40倍量的95%乙醇超聲提取3次，每次40 min，提取功率300 W。研究結果表明，用超聲提取法在保證提取效率的前提下，簡化了文獻報道的溶劑回流提取法對金線蓮總黃酮類的提取工藝，操作方法簡便，提取效率較高，建立的超聲提取金線蓮黃酮類成分的最佳工藝條件，有助于金線蓮檢測質量的控制。

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R284.2

B

1000-338X（2017）01-0040-03

2016-09-08

福建省炮制傳承基地建設重點學科專項（X2014131-學科）。

王澄林（1991—），女，2014級中藥學專業碩士研究生，主要從事藥物分析與質量評價研究。

林羽（1966—），男，主任藥師。E-mail：yulam@163.com