半枝蓮阻滯人結腸癌細胞周期的機制

張鈴，方翌，蔡巧燕，林珊，魏麗慧，彭軍（福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福建福州350122）

半枝蓮阻滯人結腸癌細胞周期的機制

張鈴，方翌，蔡巧燕，林珊，魏麗慧，彭軍
（福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福建福州350122）

目的研究半枝蓮氯仿極性部位提取物（ECSB）阻滯人結腸癌細胞周期的機制。方法用ECSB干預結腸癌細胞株HCT-8、SW620，檢測其細胞周期相關基因的表達。結果ECSB干預SW620細胞后，其p16表達上升，PCNA表達下降；ECSB干預HCT-8細胞后，Cyclin D1、CDK2、CDK4表達下降。結論ECSB通過調(diào)控細胞周期相關基因的表達，抑制人結腸癌細胞的增殖。

半枝蓮氯仿極性部位提取物；結腸癌；細胞周期

結腸癌（colorectal cancer，CRC）的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，目前治療CRC的常見方法有手術、放療、化療、靶向治療等，但均未取得突破性進展，主要原因是腫瘤細胞具有無限增殖能力，容易產(chǎn)生復發(fā)和轉(zhuǎn)移。半枝蓮為唇形科黃芩屬植物半枝蓮Scutellaria barbata D.Don的干燥全草，歸肺、肝、腎、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、活血化瘀、利尿消腫的功效［1］。臨床證實半枝蓮與其它藥物聯(lián)合應用，可明顯減輕患者放化療的副作用，改善生活質(zhì)量，延長生存時間。半枝蓮對腫瘤的療效確切，但由于組分復雜使得其抗腫瘤的有效成分仍然未知。我們前期研究將半枝蓮萃取為氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚，初步確定氯仿極性部位提取物（ECSB）為4個部位中最有效的抗腫瘤部位［2］。本研究從ECSB阻滯人結腸癌細胞周期方面進行研究，以確定半枝蓮的物質(zhì)基礎及作用機制，為臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 細胞來源結腸癌細胞株SW620（上海中科院細胞庫）；HCT-8（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.2 藥物與試劑半枝蓮購于福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂；L-15、RPMI-1640培養(yǎng)基（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；胰蛋白酶、胎牛血清、Trizol、Super-Script III First-Strand Synthesis System試劑盒（美國Invitrogen公司）；Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix試劑盒（美國Fermentas公司）；氯仿、異丙醇、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；引物合成、DEPC處理水（上海生物工程有限公司）；Taq酶（德國Sigma公司）；GenomeLabTM Gexp start kit試劑盒、分離膠、甲酰胺（SLS）、DSS-400（美國Beckman公司）。

1.3 主要儀器CO2培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司），PCR擴增儀（美國Bio-rad公司），GenomeLabTM Gexp遺傳分析系統(tǒng)（美國Beckman公司）。

2 實驗方法

2.1 半枝蓮不同極性部位提取物的制備制備方法見文獻［2］。

2.2 細胞培養(yǎng)將結腸癌細胞株SW620和HCT-8分別接種到250 mL的培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清、100 U／mL青霉素、100 μg／mL鏈霉素的L-15和RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進行傳代培養(yǎng)。

2.3 RT-PCR檢測SW620細胞基因表達SW620以5×105個／mL接種于6孔板中，加入25、50、75 μg／mL ECSB干預24 h后收集細胞。用Trizol提取總RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肧uperScript III First-Strand Synthesis System試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，將獲得的cDNA通過PCR擴增得到p16（多腫瘤抑制因子）、PCNA（增殖細胞核抗原）基因，以GAPDH為內(nèi)參。PCR擴增用Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix試劑盒，具體操作按試劑盒說明書。PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓80～100 V。電泳結束后，用凝膠成像系統(tǒng)進行圖像采集。

2.4 Gexp技術檢測HCT-8細胞基因表達HCT-8以2×105個／mL接種于6孔板中，加入150 μg／mL ECSB干預48 h后收集細胞，用Trizol提取總RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ锱渲疲簩⒁獧z測的所有基因的下游引物混合，配制終濃度為500 nmol／L的混合液。將要檢測的所有基因的上游引物混合，配制終濃度為200 nmol／L的混合液。逆轉(zhuǎn)錄時用下游混合引物，PCR時用上游混合引物，其余加樣按試劑盒說明書操作。逆轉(zhuǎn)錄的反應程序為：48℃1 min，42℃1 h，95℃5 min，4℃hold。將獲得的cDNA進一步通過PCR擴增得到Cyclin D1（細胞周期素D1）、CDK2（細胞周期素依賴性激酶2）、CDK4（細胞周期素依賴性激酶4）基因。PCR的反應程序為：94℃1 min（94℃30 s，55℃30 s，70℃1 min）×35個循環(huán)。用SLS稀釋Marker（DSS-400），PCR產(chǎn)物經(jīng)稀釋后進行毛細管電泳分離，用默認分析參數(shù)對毛細管電泳的結果進行片段分析。以TBP、GAPDH、CYPLOPHOH為參考基因，將其峰值求幾何均數(shù)，各基因的峰值與該幾何均數(shù)的峰值相除，得到各基因的相對表達量。

3 實驗結果

實驗結果見圖1、表1。

圖1 RT-PCR檢測SW620細胞在ECSB干預后其p16、PCNA的mRNA表達量

表1 Gexp檢測HCT-8細胞在ECSB干預后其Cyclin D1、CDK4、CDK2的mRNA表達量

表1 Gexp檢測HCT-8細胞在ECSB干預后其Cyclin D1、CDK4、CDK2的mRNA表達量

注：與0 μg／mL組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01。

ECSB濃度150 μg／mL組0 μg／mL組CDK2 0.41±0.111）0.70±0.28 n 3 3 Cyclin D1 1.73±0.602）17.45±4.58 CDK4 1.78±0.222）6.04±0.50

4 討論

4.1 細胞周期中可以影響細胞從一個時期向另一個時期轉(zhuǎn)換的時間點，稱為限制點。常見的限制點有G1／S、G2／M和紡錘體裝配限制點。惡性腫瘤的生物學特性之一就是使這些限制點紊亂，導致細胞的失控性增殖［3］。紅花多糖能阻滯肝癌SMMC-7721細胞在G2／M期［4］，白花蛇舌草能阻滯結腸癌HT-29細胞在G1／S期［5］。細胞周期的調(diào)控可分為外源性和內(nèi)源性途徑進行，內(nèi)源性途徑主要是通過細胞周期素（Cyclins）、細胞周期素依賴性激酶（CDKs）、細胞周期素依賴性激酶抑制因子（CKIs）的調(diào)控來實現(xiàn)［6］。CDKs與不同的Cyclins結合形成二聚體后驅(qū)動細胞進入不同的時期，其中CDK2、CDK4能結合Cyclin D1，控制細胞G1／S期的進展。研究［7］表明許多腫瘤的CDKs和Cyclins常過度表達，從而導致其細胞周期的異常活躍。CKIs參與細胞周期限制點的負調(diào)控，阻滯細胞周期進展，這些小分子蛋白家族為細胞周期抑制蛋白，包括p16、p53、p27、pRB［8］，其中p16基因位于人類的第9號染色體短臂2區(qū)1帶（9p21），能抑制CDK4的活性，阻止細胞進入S期，在許多惡性腫瘤中存在純合性缺失［9－10］。

4.2 我們前期研究通過colony formation實驗證實，ECSB能顯著抑制SW620細胞的增殖，并且是通過下降Cyclin D1和CDK4的表達所介導的，但對p16的影響不明確。本實驗在前期研究基礎上進一步證實SW620細胞在ECSB干預24 h后，其p16的表達呈劑量依賴性的上調(diào)。本實驗在另外一株結腸癌細胞HCT-8中也得到相同結果。150 μg／mL ECSB能下調(diào)HCT-8細胞的Cyclin D1、CDK4、CDK2，提示ECSB可通過調(diào)控細胞周期的相關基因起到抑制細胞增殖的作用。

4.3 ECSB能顯著下調(diào)SW620細胞的PCNA表達，并呈劑量依賴性，證明了ECSB能抑制結腸癌細胞的增殖。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2005：77-78.

［2］ZHANG L，CAI Q，LIN J，et al.Chloroform fraction of Scutellaria barbata D.Don promotes apoptosis and suppresses proliferation in human colon cancer cells［J］.Molecular medicine reports，2014，9（2）：701-706.

［3］孫陽，史默怡，王亞賢.中藥對腫瘤細胞周期影響的研究進展［J］.中醫(yī)藥信息，2013，29（6）：109-111.

［4］梁穎，張曉莉，陶冀，等.紅花多糖對人肝癌SMMC-7721細胞增殖的抑制作用［J］.中醫(yī)藥學報，2011，5（5）：32-35.

［5］LIN M，LIN J，WEI L，et al.Hedyotis diffusa Willd extract inhibits HT 29 cell proliferation via cell cycle arrest［J］.Experimental and therapeutic medicine，2012，4（2）：307-310.

［6］彭飛，彭玲，黃瓊瑤.血根堿調(diào)控腫瘤細胞周期機制研究進展［J］.湖南中醫(yī)雜志，2011，27（2）：130-132.

［7］ASGHAR U，WITKIEWICZ A K，TURNER N C，et al.The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy［J］.Nature reviews Drug discovery，2015，14（2）：130-146.

［8］韓世愈，王嬌.細胞周期蛋白在惡性腫瘤中的表達及其在腫瘤治療中的作用［J］.分子診斷與治療雜志，2013，5（15）：357-360.

［9］PEURALA E，KOIVUNEN P，HAAPASAARI K M，et al.The prognostic significance and value of cyclin D1，CDK4 and p16 in human breast cancer［J］.Breast Cancer Research，2013，15（1）：1-10.

［10］王新華，崔涌，孟憲杰.PTEN、p16、突變型p53在膀胱癌組織中的表達及意義［J］.山東醫(yī)藥，2013，53（10）：37-39.

R285.5

A

1000-338X（2017）01-0024-02

2016-10-05

福建省自然科學基金資助課題（2015J01687）；福建省衛(wèi)生廳青年科研項目資助課題（2014-2-29）；

張鈴（1986—），女，理學碩士，實驗師，主要從事中藥抗腫瘤的機制研究。

彭軍（1969—），男，教授。E－mail：pjunlab@hotmail.com