栝樓桂枝湯對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后PARP-1表達(dá)的影響

謝晴晴，南麗紅，陳喆鳴，蔡婷婷，陳紅，黃枚（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

栝樓桂枝湯對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后PARP-1表達(dá)的影響

謝晴晴，南麗紅，陳喆鳴，蔡婷婷，陳紅，黃枚
（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

目的觀察栝樓桂枝湯對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織中多聚（腺苷二磷酸核糖）聚合酶-1（PARP-1）表達(dá)的影響，探討栝樓桂枝湯的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。方法用線栓法制備大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠模型，手術(shù)當(dāng)日大鼠清醒后用栝樓桂枝湯干預(yù)，每日1次，7天后用Longa評(píng)定法評(píng)價(jià)神經(jīng)功能損傷程度，TTC染色檢測(cè)腦梗死體積，HE染色檢測(cè)缺血側(cè)大腦皮層的病理改變，免疫組化法檢測(cè)缺血側(cè)大腦皮層PARP-1的表達(dá)。結(jié)果與模型組比較，栝樓桂枝湯組能明顯改善MCAO模型大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，縮小腦梗死體積，減輕大腦皮層病理?yè)p傷，減少大腦皮層PAPR-1的表達(dá)。結(jié)論栝樓桂枝湯能有效降低缺血再灌注后腦組織的PARP-1表達(dá)，具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用。

栝樓桂枝湯；腦缺血再灌注損傷；多聚聚合酶-1

栝樓桂枝湯（gualou guizhi decoction，GLGZD）由栝樓根（天花粉）、桂枝、白芍、甘草、生姜、大棗組成，具有滋養(yǎng)經(jīng)脈、柔筋緩急的功效，治療中風(fēng)后肢體痙攣療效較好［1］。課題組前期研究表明，GLGZD可通過(guò)多種機(jī)制起到神經(jīng)保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚未闡明［2-4］。本研究旨在觀察GLGZD對(duì)MACO模型大鼠大腦皮層組織中多聚聚合酶-1（Poly（ADP-ribose）polymerase-1，PARP-1）蛋白表達(dá)的影響，探討GLGZD對(duì)MCAO模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠115只，體質(zhì)重260～280 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物栝樓桂枝湯水提物（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，1.44 g生藥／mL）；尼莫地平（山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑PARP-1兔多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；Elivision plus免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、山羊血清（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；2，3，5氯化三苯基四氮唑（TTC）（美國(guó)Sigma公司）；戊巴比妥鈉（德國(guó)默克公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器TS-12D生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（湖北省孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）；YB-6LF生物組織石蠟包埋機(jī)、YT-7FB生物組織攤烤片機(jī)（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；HM325石蠟切片機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；DM4000B LED光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MCAO動(dòng)物模型制作115只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組15只，造模組100只，參照Longa的方法制作MCAO模型［5］。禁食不禁水12 h，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（60 mg／kg）麻醉，取仰臥位，去除頸前被毛，常規(guī)消毒，沿頸正中線切口，沿右側(cè)胸鎖乳突肌和頸前肌群之間分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。將甲聚硅氧烷涂層的魚(yú)線從左頸中動(dòng)脈插入大腦中動(dòng)脈的起始端，栓塞2 h后，拔出魚(yú)線再灌注。假手術(shù)組大鼠除了不栓塞大腦中動(dòng)脈，其余行相同的操作。大鼠自然蘇醒后，參照Longa評(píng)定法，對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)功能損傷程度的評(píng)價(jià)。0分，無(wú)缺陷；1分，不能伸展對(duì)側(cè)前肢；2分，對(duì)側(cè)前肢屈曲；3分，輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分，嚴(yán)重轉(zhuǎn)圈；5分，對(duì)側(cè)癱瘓。3～4分為造模成功，納入實(shí)驗(yàn)組，評(píng)分至少有2人參與。

2.2 分組與給藥將造模成功的大鼠根據(jù)評(píng)分分為模型組20只，3.6 g／kg GLGZD組（低劑量組）20只，7.2 g／kg GLGZD組（中劑量組）20只，14.4 g／kg GLGZD組（高劑量組）20只，6 mg／kg尼莫地平組20只。給藥組于大鼠手術(shù)當(dāng)日清醒后，按1 mL／100 g體質(zhì)重灌服相應(yīng)的藥物，每日1次，連續(xù)7 d。假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水，7 d后取材進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

2.3 TTC染色麻醉大鼠，斷頭取腦，-20℃冰箱冷卻20 min取出，用大鼠腦膜具于視交叉及其前后2 mm處，2 mm冠狀切片，將切片置于TTC染液中，37℃避光孵育30 min。正常組織染成玫瑰紅色，梗死組織呈白色。數(shù)碼相機(jī)拍照，用Image J 1.37測(cè)量，分析梗死區(qū)體積占對(duì)側(cè)腦體積的百分比。

2.4 HE染色麻醉大鼠用生理鹽水和4%多聚甲醛按順序心臟灌注，開(kāi)顱取腦，大鼠腦膜具中2 mm切片，置4%多聚甲醛中固定過(guò)夜，常規(guī)石蠟包埋，5 μm切片，蘇木素-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

2.5 PARP-1蛋白表達(dá)用免疫組化染色二步法進(jìn)行檢測(cè)。步驟：5 μm石蠟切片，3%過(guò)氧化氫室溫孵育10 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；經(jīng)0.01 M枸櫞酸鈉緩沖液（pH為6）微波修復(fù)總時(shí)間為15 min，室溫冷卻后，山羊血清封閉20 min，滴加1∶600稀釋的兔多克隆PARP-1抗體，4℃孵育過(guò)夜；次日滴加辣根酶標(biāo)記的抗羊多聚體室溫孵育20 min，DAB顯色3 min，蘇木素復(fù)染1 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。細(xì)胞核呈棕黃色為PARP-1陽(yáng)性表達(dá)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，用Image-pro plus 6.0軟件觀察和記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表1～表3、圖1～圖2。

表1 GLGZD對(duì)大鼠神經(jīng)功能損傷的影響

表1 GLGZD對(duì)大鼠神經(jīng)功能損傷的影響

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組尼莫地平組神經(jīng)功能評(píng)分／分0 2.33±0.491）1.75±0.62 1.67±0.652）1.58±0.512）1.50±0.522）大鼠／只14 14 14 14 14 14

表2 GLGZD對(duì)大鼠腦梗死體積的影響

表2 GLGZD對(duì)大鼠腦梗死體積的影響

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

大鼠／只組別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組尼莫地平組6 6 6 6 6 6腦梗死體積／% 0 30.18±4.991）22.38±2.57 17.32±3.322）13.54±2.843）12.98±1.633）

表3 GLGZD對(duì)大鼠缺血側(cè)大腦皮層中PARP-1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的影響

表3 GLGZD對(duì)大鼠缺血側(cè)大腦皮層中PARP-1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的影響

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

大鼠／只組別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組尼莫地平組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10.97±0.66 143.23±9.191）90.87±11.30 66.50±7.162）55.93±7.283）61.13±5.813）6 6 6 6 6 6

3.2 HE染色由圖1可見(jiàn)，假手術(shù)組大鼠：大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞無(wú)明顯病理改變，細(xì)胞排列整齊，輪廓清晰，著色均勻；細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核、核仁清晰，胞漿豐富；細(xì)胞周?chē)g隙無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)水腫。模型組大鼠：大量細(xì)胞變形、壞死，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間的間隙增寬，結(jié)構(gòu)略顯疏松，形態(tài)異常，不規(guī)則，胞體縮小，胞質(zhì)凝集，胞核固縮濃染，有的細(xì)胞界限不清，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫明顯。給藥組與MCAO模型組大鼠相比，病理狀態(tài)明顯改善，組織壞死程度和數(shù)量明顯減輕或減少。

圖1 6組大鼠大腦皮層組織病理圖（×200）

圖2 6組大鼠大腦皮層組織中PARP-1蛋白的表達(dá)（×400）

4 討論

4.1 PARP-1是廣泛存在于真核細(xì)胞的DNA修復(fù)酶，主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，少量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，在感受和調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激以及損傷修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。機(jī)體中PARP-1依據(jù)DNA損傷程度及其底物尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的水平發(fā)揮雙重作用。在正常或DNA輕度受損的細(xì)胞中，PARP-1可修復(fù)受損DNA，神經(jīng)細(xì)胞能耐受缺血而存活。在腦缺血早期，PARP-1過(guò)量表達(dá)則通過(guò)耗竭大量的底物NAD和ATP，從線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)AIF到細(xì)胞核內(nèi)，炎癥介質(zhì)的過(guò)量表達(dá)，減少促活因子的表達(dá)等途徑加劇缺血后腦組織損傷［7－8］。

4.2 研究結(jié)果顯示，GLGZD可明顯減輕MCAO模型大鼠的神經(jīng)功能癥狀，縮小腦梗死體積，減輕缺血再灌注后大腦皮層的病理?yè)p傷，提示GLGZD具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用。免疫組化法檢測(cè)結(jié)果顯示，GLGZD治療后缺血側(cè)大腦皮層中PARP-1蛋白的表達(dá)量明顯少于模型組，提示GLGZD可通過(guò)下調(diào)大腦皮層中PARP-1蛋白的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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R285.5

A

1000-338X（2017）01-0021-03

2016-11-16

福建省自然科學(xué)基金資助課題（2017J01837），國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510393022）

謝晴晴（1990—），女，2014級(jí)中藥學(xué)專(zhuān)業(yè)碩士研究生，主要從事中藥神經(jīng)藥理學(xué)研究。

黃枚（1966—），女，教授。E－mail：hmei0303@qq.com