前列寧膠囊調控Caspase-3通路治療良性前列腺增生的機制

周建衡，林久茂，鐘曉勇，洪振豐（.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建福州50；.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州50；.福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建福州50004）

·實驗研究·

前列寧膠囊調控Caspase-3通路治療良性前列腺增生的機制

周建衡1，林久茂2，鐘曉勇3，洪振豐2
（1.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建福州350122；2.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州350122；3.福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建福州350004）

目的研究前列寧膠囊治療良性前列腺增生（BPH）的機制。方法用SD大鼠制作BPH模型，光鏡觀察6組大鼠前列腺組織病理改變，Real-time PCR法檢測6組大鼠前列腺組織Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bax及bcl-2基因表達，BPH-1細胞培養，前列寧膠囊不同劑量干預，比色法分析Caspase-8、Caspase-3活化，Real-time PCR檢測Fas、Bax及bcl-2基因表達，Westen-blot檢測Fas、bcl-2、Bax蛋白表達。結果病理顯示前列腺病理組織明顯改善，前列腺組織中Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bax基因表達增強，bcl-2表達降低；BPH-1細胞培養，前列寧膠囊干預后，倒置顯微鏡觀察BPH-1細胞胞密度明顯減少，細胞變小，細胞凋亡增加，前列寧膠囊不同劑量干預比色法分析Caspase-8、Caspase-3活化增強，Real-time PCR、Westen-blot檢測Fas、Bax基因及蛋白表達增強，bcl-2降低。結論前列寧膠囊調控Caspase-3通路中的相關因子，促進前列腺組織細胞凋亡，是其治療BPH的機制。

前列寧膠囊；前列腺良性增生；細胞凋亡

課題組前期研究發現前列寧膠囊治療良性前列腺增生（BPH）有明顯效果，能夠促進BPH-1凋亡、抑制細胞增殖，并調控多種細胞因子，但其治療BPH機制尚未明了［1-4］。本實驗通過研究前列寧膠囊對caspase-3信號通路過程中的相關因子Fas、caspase-8的影響，探討前列寧膠囊治療BPH的機制。

1 材料

1.1 動物及細胞株健康SPF級成年雄性SD大鼠60只，體質量190～220 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬2007-0005），批號：0017446。正常喂養，在實驗室適應環境5 d后進行實驗。BPH-1細胞株（南開大學生命科學院分子生物研究所）。

1.2 藥物制備前列寧膠囊（福建省人民醫院院內制劑，批號：閩Z20110009）。動物治療濃度：前列寧膠囊低中高劑量組［2.25 g／（kg／d）組、4.5 g／（kg／d）組、9 g／（kg／d）組］。細胞干預濃度：用40%DMSO溶解，配制成0.5 g／mL溶液，經高壓滅菌后，4℃保存待用。用時用培養基稀釋成10 mg／mL過濾后再配成0、1.25、2.5、5 mg／mL的終濃度。

1.3 試劑丙酸睪酮注射液（上海通用藥業股份有限公司，規格：25 mg／mL，批號：H31020524）；保列治（杭州默沙東制藥公司，批號：J20050041）；RT試劑盒、Trizol、PCR試劑盒（大連Takara Biotechnolo gy公司）；Taq聚合酶、Rnaseinhibitor（日本TaK-aRa公司）；引物由上海英俊生物有限公司合成；RPMI 1640培養基、胰蛋白酶，胎牛血清（FBS）（美國Hyclone公司）；Caspase-3、Caspase-8檢測試劑盒（美國Biovision公司）；Caspase-3、Caspase-8底物Asp-Glu-Val-Asp（DEAD）-p-nitroaniline（pNA），Bcl-2、Bax、Fas一抗、二抗，DAB（河北博海生物工程開發有限公司）。

1.4 儀器RE-2000旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；DLSB-5／20低溫冷卻循環泵（鄭州長城科工貿有限公司）；B-290型實驗室小型噴霧干燥機（瑞士Buchi公司）；多功能彩色細胞圖象分析管理系統（美國Media Cybernetics公司）；ELX800酶標儀（美國BioTek公司）；HF212UV CO2培養箱、IX70熒光倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；GST-1型PCR儀（英國Gstorm公司）；Gel DOC 2000型凝膠成像分析系統、APC 300型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；DU-650型蛋白核酸分析儀（美國Beckman公司）；LG16-3高速冷凍離心機（北京時代北利離心機有限公司）；流失細胞儀（美國BD公司）。

2 方法

2.1 BPH大鼠動物模型的制備、給藥及取材SPF級雄性SD大鼠60只，100 mg／kg氯胺酮腹腔注射麻醉，經陰囊行無菌手術，摘除雙側睪丸，恢復1周

后，每只皮下注射5 mg／（kg／d）丙酸睪酮，連續28 d，每周稱體質量1次。造模成功后，6組繼續注射造模的同時，空白對照組和病理模型組大鼠灌服生理鹽水，其余6組按照相應劑量給藥。給藥劑量為：空白組、病理模型組生理鹽水10 ml／（kg／d）、保列治組0.5 mg／（kg／d）、前列寧膠囊低劑量組2.25 g／（kg／d）、中劑量組4.5 g／（kg／d）、高劑量組9 g／（kg／d），灌胃給藥每日1次，連續28 d。給藥期間，每周稱體質量／次以調整給藥劑量。末次灌胃后禁食24 h，各鼠稱質量，麻醉，腹主動脈取血，分離出完整的前列腺組織，測量前列腺濕重和體積，計算前列腺指數。6組取相同部位的前列腺組織1塊，10%福爾馬林固定液固定，待測。6組取50～100 mg前列腺組織保存于液氮中，待測。

2.2 BPH-1細胞培養及形態學觀察BPH-1細胞株置含10%熱滅活FBS的RPMI-1640培養液中，于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中培養。對數生長期的BPH-1細胞經胰酶消化后，BPH-1細胞按2×105、個細胞／孔接種到6孔板中，每組設0、1.25、2.5、5 mg／mL劑量組，2個復孔，每孔用2 mL培養液，培養24 h后，用不同濃度的前列寧膠囊處理，前列寧膠囊干預BPH-1細胞培養24 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態變化并拍照。

2.3 RealtimePCR法檢測大鼠前列腺組織中Caspase-3、Caspase-8、Fas、Bax、Bcl-2及BPH-1中Fas、Bax、Bcl-2基因表達取新鮮凍存前列腺組織和BPH-1細胞，Trizol法提取細胞總RNA，Nanodrop蛋白核酸分析儀檢測RNA純度和濃度。進行逆轉錄反應（反應體系20 μL），得到cDNA模板。取cDNA模板1 μL進行反應，反應總體積20 μL，反應體系包括2×SYBR GreenMaster Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DEPC水7 μL，混勻。擴增條件為95℃預變性2 min（95℃變性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸60 s，循環40次），引物見表1和表2。上機進行擴增，在每次循環延伸處收集熒光信號，分析整理數據。

表1 BPH-1細胞Fas、Bax、Bcl-2和GAPDH基因的引物序列

表2 大鼠Fas、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、GAPDH基因的引物序列

2.4 比色法分析BPH-1細胞中Caspase-8、Caspase-3的活化BPH-1細胞按2×105個細胞／孔接種到6孔板中，每孔用2 mL培養液，培養24 h后，前列寧前囊高中低濃度處理24 h后的細胞，用裂解液在冰上放置30 min，裂解的細胞16 000 r／min離心10 min，100 μg的蛋白質加50 μL的Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）-p-nitroaniline-pNA（caspase-3特異底物）或Leu-Glu-His-Asp-pNA（caspase-8特異底物），37℃避光反應2 h，用酶標儀檢測樣品在405 nm處的吸光度值。

2.5 檢測BPH-1細胞中Fas、Bax、Bcl-2蛋白表達Western Blot法檢測Bax的蛋白表達。BPH-1細胞按2×105個細胞／孔接種到6孔板中，每孔用2 mL培養液，培養24 h后，前列寧前囊高中低濃度處理24 h后的細胞，用裂解液抽提。含有等量蛋白的細胞裂解液用樣品緩沖液溶解后，將細胞的蛋白樣品定量，變性，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜。脫脂牛奶封閉2 h；洗膜，加入Fas、Bax、Bcl-2（稀釋倍數1∶1 000）的一抗以及β-actin（稀釋倍數1∶1 000）作為陽性對照，4℃震蕩過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（稀釋倍數1∶25 000）后，室溫孵育1 h，用含0.25%tween-20的TBS洗膜，加1∶1的ECL發光液，25℃溫育5 min，立即曝光，等條帶清晰后將膠片取出，用凝膠成像系統掃描并進行數據分析。2.6統計學方法實驗數據用表示，用SPSS 12.0統計軟件進行分析，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異性具有統計學意義。

3 結果

3.1 前列寧膠囊對大鼠前列腺組織病理形態的影響正常組大鼠前列腺組織細胞腺上皮呈單層柱狀，核橢圓形，腺體無擴張，間質無增生；模型組腺上皮呈假復層，細胞排列緊密，腺腔上皮增生呈多層，QC及保列治治療組較模型組病變明顯減輕，腺上皮呈單層柱狀，核位于基底部，腺體數目明顯減少，見圖1。

圖1 SD大鼠前列腺組織病理改變圖（×100）

3.2 前列寧膠囊對SD大鼠前列腺組織中Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bax、Bcl-2基因表達見表3。

表3 SD大鼠前列腺組織Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bax、Bcl-2基因表達

表3 SD大鼠前列腺組織Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bax、Bcl-2基因表達

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別空白組模型組保列治組低劑量組中量組組高劑量組Bcl-2 1.0±0.1 3.1±0.51）1.6±0.32）2.4±0.22）1.6±0.42）1.3±0.42）Fas 4.0±1.1 2.0±0.41）3.7±0.82）2.9±0.22）3.6±0.42）3.7±0.42）Caspase-8 4.2±0.4 2.9±0.21）3.3±0.42）3.5±0.42）4.6±0.82）3.5±0.52）Caspase-3 4.8±0.8 2.3±0.51）2.6±0.32）2.5±0.8 4.5±0.62）4.0±0.22）Bax 1.0±0.2 0.5±0.11）0.8±0.22）0.6±0.1 0.9±0.22）1.1±0.22）

圖2 高中低劑量前列寧膠囊干預BPH-1細胞倒置顯微鏡鏡下改變圖（×100）

3.3 前列寧膠囊對BPH-1細胞形態及細胞活力的影響見圖2。圖2所示，通過倒置顯微鏡可觀察到細胞形態逐漸改變，細胞數逐漸減少，細胞多呈圓形，體積縮小，細胞懸浮，脫落而死亡，細胞完整性和數量下降。

3.4 前列寧膠囊對BPH-1細胞中Caspase-8、caspase-3活化影響見表4。

表4 QC干預BPH-1對Caspase-8和Caspase-3活化的影響

表4 QC干預BPH-1對Caspase-8和Caspase-3活化的影響

注：與0 mg／mL組比較，1）P＜0.05。

組別0 mg／mL組1.25 mg／mL組2.5 mg／mL組5 mg／mL組Caspase-3 1.0±0.1 1.3±0.11）1.8±0.11）3.0±0.21）Caspase-8 1.0±0.2 1.1±0.3 1.4±0.21）1.6±0.41）

前列寧膠囊作用24 h后，BPH-1細胞中Caspase-8、caspase-3的活化，隨著藥物濃度的升高。

3.5 前列寧膠囊對BPH-1細胞Fas、Bax、Bcl-2基因及蛋白的影響見表5、圖3。

表5 高中低劑量前列寧膠囊干預BPH-1對Fas、Bax、Bcl-2基因的影響

表5 高中低劑量前列寧膠囊干預BPH-1對Fas、Bax、Bcl-2基因的影響

注：與0 mg／mL組比較，1）P＜0.05。

組別0 mg／mL組1.25 mg／mL組2.5 mg／mL組5 mg／mL組Bcl-2 1.0±0.41 0.6±0.071）0.3±0.121）1.5±0.341）Bax 1.0±0.04 1.5±0.221）1.6±0.121）1.8±0.231）Fas 1.0±0.62 1.0±0.231）1.5±0.341）1.7±0.571）

圖3 高中低劑量前列寧膠囊干預BPH-1對Fas、Bax、Bcl-2蛋白影響的電泳圖

4 討論

4.1 細胞凋亡是遵循自身的程序，自己結束其生命的過程，這個過程中在一系列酶參與基因控制下，細胞有程序死亡。Caspase家族在細胞凋亡過程中發揮著重要作用，Caspase凋亡信號通路可通過外源性和內源性凋亡通路在TNF、Fas的啟動劑誘導下，最終導致caspase-8活化，進一步使caspase-3活化，并引起隨后的級聯反應，最終導致細胞凋亡［5-10］。

4.2 在本實驗中，用大鼠模型及BPH-1細胞培養，前列寧膠囊干預治療，大鼠實驗表明，正常組大鼠前列腺組織細胞腺上皮呈單層柱狀，核橢圓形，位于基底部，腔內無或少許分泌物，腺體無擴張，間質無增生；模型組腺上皮呈假復層，細胞排列緊密，核位于基底部，腺腔上皮增生呈多層表明造模成功。前列寧膠囊及保列治治療組較模型組病變明顯減輕，腺上皮呈單層柱狀，核位于基底部，腺體數目明顯減少，表明前列寧膠囊對大鼠前列腺增生具有明顯治療作用。Real-time PCR檢測各組大鼠前列腺組織中Fas、caspase-8、caspase-3、Bax、Bcl-2基因顯示，前列寧膠囊治療組中，Fas、caspase-8、caspase-3、Bax基因表達明顯增強，并成量效關系，Bcl-2基因表達隨前列寧膠囊濃度增加明顯減弱，表明前列寧膠囊能促進BPH大鼠前列腺凋亡，并對caspase-3通路中相關因子有明顯調控作用。前列寧膠囊干預BPH-1細胞培養顯示，前列寧膠囊干預后倒置顯微鏡觀察細胞活力明顯降低，凋亡增多；比色法檢測細胞中Caspase-8、Caspase-3活化增加，Realtime PCR及Westen-blot檢測Fas、Bax基因、蛋白表達增強，Bcl-2基因、蛋白表達減弱，離體實驗進一步驗證前列寧膠囊治療BPH可能是增強caspase-3活力，促進相關因子表達。

4.3 實驗結果表明，前列寧膠囊對BPH具有明顯治療作用，其治療機制是促進前列腺細胞凋亡，抑制其增殖。由于細胞凋亡受多種因子調控，本實驗中前列寧膠囊可上調Fas、caspase-8、caspase-3含量，使Bax基因、蛋白表達增強，Bcl-2基因、蛋白表達減弱。總之，前列寧膠囊調控caspase-3促進細胞凋亡，是其治療BPH的重要機制之一。

［1］JIANHENG ZHOU，JIUMAO LIN，ZHENFENG HONG，et al.Jun peng.Qianliening capsule treats benign prostatic hyperplasia through regulating the expression ofsex hormones，estrogen receptor and androgen receptor［J］.African Journal of Pharmacy and Pharmacology，2012，6（3）：173-180.

［2］XIAOYONG ZHONG，JIUMAO LIN，JIANHENG ZHOU，et al. Qianliening capsule treats benign prostatic hyperplasia（BPH）by down-regulating theexpression of PCNA，CyclinD1 and CDK4［J］.African Journal of Biotechnology，2012，11（30）：7731-7737.

［3］周建衡，林久茂，洪振豐，等.前列寧膠囊對BPH大鼠前列腺組織中IL-10 TNF-α的影響［J］.中華中醫藥學刊，2010，28（12）：2657-2569.

［4］林久茂，周建衡，鐘曉勇，等.前列寧膠囊對BPH大鼠EGF及EGFR表達的的影響［J］.福建中醫藥，2010，41（6）：49-51.

［5］SUN Q，ZHONG W，ZHANG W，et al.Zinc deficiency mediates alcohol-induced apoptotic cell death in the liver of rats through activating ER and mitochondrial cell pathways［J］.Lab Invest，2015，95：223-236.

［6］LONG F Y，CHEN Y S，ZHANG L，et al.Pennogenyl saponins induce cell cycle arrest and apoptosis in human hepatocellular careionma HepG2 cells［J］.J Ethnopharmaco，2015，162：112-120.

［7］SEONG M K，LEE J Y，BYEON J，et al.Bcl-2 is a highly signifecant prognlstic marker of hormone-receptor-positive，human epidermal growth factor receptor-2-negative breastcancer［J］. Breast Cancer Res Treat，2015，150：141-148.

［8］BERGHAUSER PONT LM，SPOOR JK，VENKATESAN S，et al. The Bcl-2 inhibitor Obatlclax overcomes resistance to histone deacetylase inhibitors SAHA and LBH589 as radiosensitizers in patient-derived glilblastoma stem-like cells［J］.Cenes Cancer，2014，5：445-459.

［9］CAI Y，ZOU Z，CHEN Y，et al.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells inhibits hepatocyte apoptosis after acute liver injury［J］.Int JClin Exp Pathol，2015，8：107-116.

［10］蘇苗，俞騰飛，郭敏，等.肝細胞凋亡機制的研究進展［J］.中國臨床藥理學雜志，2015，31（16）：1684-1686.

R285.6

A

1000-338X（2017）01-0009-04

2016-10-26

國家自然科學基金資助課題（81373817，81273938），福建省自然科學基金資助課題（2015J01333）

周建衡（1968—），男，副教授，主要從事老年男性疾病的中西醫結合基礎研究。

洪振豐（1953—），男，教授。E-mail：zfHong1953@163.com