瑞士乳桿菌LH-G51凍干菌粉生產工藝研究

雷 丹，韓 迪，蔣德意，甘 聃

(潤盈生物(上海)有限公司，上海 201700)

瑞士乳桿菌LH-G51凍干菌粉生產工藝研究

雷 丹，韓 迪，蔣德意，甘 聃

(潤盈生物(上海)有限公司，上海 201700)

目的：對瑞士乳桿菌LH-G51菌粉生產工藝進行優化。方法：通過單因素及正交試驗設計，確定適合LH-G51生長的發酵培養基、凍干保護劑配方及生產工藝。結果：發酵時間、碳氮源及微量元素添加量均對LH-G51生長有明顯影響。最終確定LH-G51培養基碳氮源及微量元素為葡萄糖20 g/L、大豆蛋白胨10 g/L、酵母膏15 g/L、MgSO4·7H2O為250 mg/L、MnSO4·H2O為50 mg/L、發酵時間10 h、保護劑為B。結論：根據優化工藝，LH-G51凍干菌粉活菌數可達到4.21×1011CFU/g。

瑞士乳桿菌；生產工藝；保護劑；凍干菌粉

瑞士乳桿菌是人體腸道內的一種益生菌，也是干酪制品中常用的乳酸菌發酵劑[1]，因其能產生多種活性肽以及胞外蛋白酶能優先水解α-CN 和β-CN，故其發酵乳有降血壓、抑制腫瘤、降膽固醇等作用[2-5]。食用此菌發酵酸乳能促進鈣的吸收，增加骨密度和骨礦物質含量減少骨質流失[6-7]。由于瑞士乳桿菌具有這些益生保健功能，使得此菌具有較好的應用市場，因此提高其產量以及菌粉活菌含量比較具有研究意義。

有研究表明，瑞士乳桿菌在發酵過程中極易自溶，不適于冷凍干燥制備發酵劑[8-9]，本研究針對分離自內蒙古傳統酸奶酪中的一株瑞士乳桿菌LH-G51，對其發酵培養基、保護劑進行篩選，并進行小試驗證及工藝優化，來提高其凍干菌粉活菌數，再進行中試放大，為后續瑞士乳桿菌的生產應用提供重要的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 瑞士乳桿菌LH-G51，由潤盈生物工程(上海)有限公司菌種保藏中心提供。

1.1.2 基礎培養基 MRS：葡萄糖 20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉10 g/L、酵母膏5 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、檸檬酸氫二胺2 g/L、乙酸鈉5 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.19 g/L、吐溫-80 1 g/L。

1.1.3 計數培養基 MRS，0.8 g/L瓊脂粉。

1.1.4 冷凍干燥保護劑 選取工廠生產所用5種乳桿菌冷凍干燥保護劑A、B、C、D、E(表1)。

表1 瑞士乳桿菌LH-G51凍干保護劑主要成分 單位：g/L

1.2 儀器與設備

15 L、100 L全自動機械攪拌發酵罐，上海佰侖公司；UV-2102C型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；FD8-6型真空冷凍干燥機，上海穎漢化工；冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化與接種發酵 將真空冷凍保藏的LH-G51菌株接種于MRS培養基中于37℃培養12 h，并傳代2次。按照3%的接種量接種，接種后的發酵培養基放置于37℃恒溫培養箱中培養12 h后檢測菌體生長情況。

1.3.2 菌濃度測定 取1 mL發酵液稀釋至一定濃度，于600 nm下用紫外分光光度計測定吸光值。

1.3.3 活菌檢測 采用平板傾注法，取0.5 mL(或0.5 g)待測樣品溶解于4.5 mL無菌生理鹽水中震蕩均勻，梯度稀釋至一定濃度后傾注平板，每個梯度取3個平行樣，37℃培養48h后統計菌落總數。

1.3.4 凍干粉制備 發酵結束后，采用冷凍離心機對發酵液進行離心，離心條件：溫度4℃、轉速7 000 r/min、時間10 min，離心后菌泥和保護劑按照1∶2進行乳化及真空冷凍干燥，凍干機參數為：冷阱溫度-80℃，真空度1 mTorr。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

將分離得到的乳桿菌LH-G51進行培養以及生理生化鑒定，觀察菌落形態和菌體形態，初步確定LH-G51為瑞士乳桿菌。

取LH-G51培養液提取細菌總DNA，擴增16S rRNA基因，測定PCR 產物全序列，測得序列進行Blast比對，圖1結果顯示，該菌株與GenBank中的瑞士乳桿菌CNRZ32相似性為99%，確定乳酸菌LH-G51為瑞士乳桿菌。

圖1 LH-G51和瑞士乳桿菌CNRZ32的BLAST比對

2.2 培養基優化

2.2.1 不同碳氮源對LH-G51的影響 碳源及氮源對乳酸菌有著重要作用，是構成細胞物質的基礎，為乳酸菌生長繁殖提供能量來源，氮源也是組成乳酸菌蛋白質和核酸的核心元素[10]。本研究在基礎培養基MRS的基礎上，碳氮源添加量不變，改變碳源及氮源的種類進行發酵。由圖2(A)可知，以葡萄糖為單一碳源時生長效果優于其他3種碳源，因此選用葡萄糖為LH-G51培養的最優碳源。由圖2(B)可知，不同氮源對LH-G51的生長影響顯著，酵母膏及大豆蛋白胨對促進LH-G51的生長效果最明顯，其原因可能是這兩種氮源物質中的氮是以氨基酸、肽小分子形式存在，因此在菌體生長過程中更容易被利用吸收[11]。A.Amrane的研究[12]也證明，培養基中提高酵母膏的添加量能促進瑞士乳桿菌的生長。

注：(A)圖中，a-乳糖、b-葡萄糖、c-蔗糖、d-低聚半乳糖；(B)圖中，A-酵母膏、B-蛋白胨、C-牛肉浸粉、D-胰蛋白胨、E-大豆蛋白胨、F-MRS對照圖2 不同碳氮源培養基對LH-G51生長的影響

圖3 不同微量元素對LH-G51生長的影響

2.2.2 碳氮源添加量正交試驗 以對LH-G51生長促進作用較大的葡萄糖、大豆蛋白胨和酵母膏為因素，采用L9(33)正交試驗，優化此三種成分的添加量，以活菌數為判斷指標，因素水平表見表2。從表3中的極差分析結果可知：根據試驗結果所得到的優化復合碳氮源配比為A2B3C1，即大豆蛋白胨10、酵母膏15 g/L、葡萄糖20 g/L。

表2 正交試驗因素水平 單位：g/L

2.2.3 微量元素對LH-G51的影響 Mg、Mn、Fe、Cu、Zn等某些微量元素是微生物活性物質構成的重要成分之一，在其代謝過程中這些微量元素還能夠激活微生物菌體內的酶類物質，且不同菌株對微量元素的需求不同[13-14]，因此需對其添加種類及添加量進行優化。由圖3可以看出，添加不同量不同種的無機鹽對LH-G51發酵液的活菌數有不同影響，Cu2+對LH-G51有抑制作用，Fe2+、Zn2+促進作用不明顯，Mg2+、Mn2+對LH-G51的生長具有較明顯促進作用，其中，MgSO4·7H2O和MnSO4·H2O的最適添加量分別為 250、50mg/L。

表3 正交試驗結果

2.3 LH-G51凍干保護劑篩選

發酵結束后發酵液離心所得到菌泥，按照表1中的5種保護劑進行乳化及凍干，由表4、表5可知，采用保護劑B乳化凍干的LH-G51菌粉活菌數最高，通過方差分析及Dun-can新復極差法進行多重比較可知，保護劑B與其他4種保護劑差異極顯著，因此，選用保護劑B配方為LH-G51的較優保護劑。

表4 5種凍干保護劑凍干LH-G51菌粉檢測結果

注：標有同一字母的數據間差異不顯著；方差分析采用Dun-can新復極差法

表5 5種凍干保護劑凍干LH-G51菌粉方差分析

注：F0.05(3，4)=5.192

2.4 LH-G51生產工藝研究

2.4.1 LH-G51在優化的培養基中的生長特性 采用優化的培養基對LH-G51進行15L發酵罐小試試驗驗證以及發酵工藝優化，選擇合適的發酵參數；再進行100L發酵罐中試放大，發酵過程中恒控pH 5.8±0.1。發酵參數為：罐溫37±1℃，通氮氣保壓，罐壓0.02～0.05MPa，接種后每隔1 h取樣檢測LH-G51生長情況及發酵液活菌數，繪制LH-G51的生長曲線。由圖4可以看出，LH-G51在優化的培養基及工藝條件下發酵，菌濃度在10 h達到最大值，此時OD600值為10.18，發酵液活菌數達到4.36×109CFU/mL，之后進入穩定期。

圖4 瑞士乳桿菌LH-G51在發酵罐中的生長曲線

2.4.2 LH-G51放罐時間的選擇 為了保證得到活性最高的凍干菌粉，從發酵9 h開始，每隔1 h取發酵液樣品進行離心、乳化及凍干，得到瑞士乳桿菌LH-G51的凍干菌粉，對菌粉進行活菌計數，由表6、表7檢測結果及方差分析數據可知，9～11 h所得菌粉樣品的活菌數相當，12 h后活菌數下降，考慮到生產成本以及菌泥產量，選擇10 h即對數生長期末期進行放罐收獲比較合適，提前放罐收率減低，推遲放罐菌會老化從而導致菌粉活力及穩定性下降。

表6 瑞士乳桿菌LH-G51不同取樣時間凍干菌粉活菌數

表7 5種凍干保護劑凍干LH-G51菌粉方差分析

注：F0.05(3，4)=6.591

3 結論

單因素及正交試驗確定LH-G51最適培養基(/L)：葡萄糖20 g、大豆蛋白胨10 g、酵母膏15 g、無水乙酸鈉5 g、K2HPO42 g、檸檬酸氫二銨2 g、MgSO4·7H2O 250 mg、MnSO4·5H2O 50 mg、Tween-80 1 g。LH-G51在此培養基中，經過小試15 L發酵罐優化工藝后，于100 L發酵罐中進行中試，通氮氣保壓，罐壓0.02～0.05 MPa，罐溫37±1℃，恒控 pH5.8±0.1，培養10 h后培養基活菌數可達到4.36×109CFU/mL。此時放罐所得的菌泥采用優化的保護劑B進行乳化凍干，得到凍干菌粉活菌數為4.21×1011CFU/g，比在MRS中培養所得的菌粉(8.6×1010CFU/g)提高了近5倍，為瑞士乳桿菌凍干菌粉進一步應用奠定了基礎。◇

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(責任編輯 李婷婷)

Production Process of Lyophilized Powder forLactobacillushelveticusLH-G51

LEI Dan，HAN Di，JIANG De-yi，GAN Dan

(BIOGROWING (SHANGHAI)CO.，LTD，Shanghai 201700,China)

ObjectiveTo optimize the production process of freeze-dried powder ofLactobacillushelveticusLH-G51.Method Optimized conditions for fermentation medium formula，freeze-drying protective agents and production processing were screened by using single factor and orthogonal experimental design.ResultAmong different factors，carbon sources，nitrogen sources and micro-elements were the key factors during the cell culture stage.The optimal culture medium for LH-G51 was glucose 20 g/L，soy peptone 10 g/L，yeast extract 15 g/L，MgSO4·7H2O 250 mg/L，MnSO4·H2O 50mg/L，the best protective agents was B.ConclusionUnder the optical conditions，the cell number of lyophilized powder of LH-G51 reached up to 4.21×1011CFU/g。

Lactobacillushelveticus；production process；protective agents；lyophilized powder

雷丹(1983— )，女，碩士，研發工程師，研究方向：益生菌制備工藝。

甘聃(1981— )，男，博士，技術研發總監，研究方向：食品營養與健康。