液體創口貼的細胞毒性檢測方法探討

嚴小莉高靜賢劉茜王莎莎楊宇民

液體創口貼的細胞毒性檢測方法探討

嚴小莉1高靜賢1劉茜1王莎莎1楊宇民2

目的 應用浸提液試驗（MTT比色法）和直接接觸試驗兩種方法對液體創口貼的細胞毒性進行檢測。方法 考慮到液體創口貼的有效使用狀態為成膜制品，故將液體創口貼室溫下成膜于培養皿上再加入細胞培養液進行浸提。結果 這兩種試驗方法在低濃度（0．125 g/皿、0．2 5 g/皿和0．5 g/皿）時結果基本一致，而高濃度（1 g/皿和2 g/皿）時差異較大。結論 在實際檢測時，需明確檢驗方法及樣品濃度。

液體創口貼；細胞毒性；直接接觸法；MTT比色法

液體創可貼是近年來新出現的有別于傳統繃帶創可貼的新型創可貼。由于液體創口貼是直接與傷口創面接觸的，故需對其進行生物學評價[1]。而體外細胞毒性實驗具有操作簡單、易標準化、周期短、敏感性強且能定量分析等優點，是醫療器械生物安全性評價體系中最重要的檢測指標之一[2]。現選擇了兩類細胞毒性試驗方法：浸提液試驗（MTT比色法）和直接接觸試驗，依據GB/T16886.5-2003和ISO 10993.5-2009標準中的方法進行了試驗[3-5]。浸提液試驗是目前檢測中最常用的細胞毒性檢測方法，但是在GB/T 16886.12-2005和ISO 10993.12-2012中只規定了固體類材料的樣品浸提制備方法，對于液體類的沒有明確的規定[6-7]。而浸提液的制備對于檢測結果的影響是非常大的，試驗中考慮到液體創口貼的有效使用狀態為成膜制品，故讓液體創口貼室溫下成膜后再加入細胞培養液進行浸提。通過兩種試驗方法的比較對液體創口貼的細胞毒性檢測方法進行了探討。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗細胞選取L929小鼠成纖維細胞株，購自中國科學院上海細胞所。主要藥品與試劑：RPMI1640培養液（GIBCO，USA），胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），MTT（AMRESCO，USA），DMSO（AMRESCO，USA）。液體創口貼隨機取樣于同一廠家送檢的同批次產品。

1.2 方法

1.2.1 直接接觸法 分別取2 g、1 g、0.5 g、0.25 g和0.125 g液體創口貼置于培養皿（直徑9 cm）中，輕輕轉動培養皿，使其均勻鋪于培養皿中，室溫晾干后，分別加入10 ml濃度為1×104U/ml的細胞懸液，取空白培養皿作為陰性對照，置于37℃、5% CO2培養箱中培養，于24 h、48 h和72 h取出培養皿，置倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，并拍照。

1.2.2 四唑鹽（MTT）比色法 分別取2 g、1 g、0.5 g、0.25 g和0.125 g液體創口貼置于培養皿（直徑9 cm）中，輕輕轉動培養皿，使其均勻鋪于培養皿中，室溫晾干后，分別加入10 ml含10%胎牛血清的RPMI1640培養液。置于37℃放置24 h制備浸提液。取高密度聚乙烯浸提液作為陰性對照品；5%的DMSO溶液作為陽性對照。將培養至近匯合的L-929細胞消化，稀釋為1×104U/ml的細胞懸液，接種至96孔培養板，每孔加入100 μl。在37℃、5% CO2培養箱中培養24 h后，移除每孔中原培養液。空白對照組加新鮮培養液200 μl，各組分別加樣品浸提液、陰性與陽性對照樣品浸提液200 μl，置CO2培養箱中繼續培養。培養72 h后將培養板取出，置倒置顯微鏡下觀察細胞形態。每孔加入質量濃度為5 g/L的MTT溶液20 μl，繼續培養4 h后移除孔內液體，加入200 μl DMSO，置振蕩器上振蕩10 min，選擇570 nm在ELX800UV型酶標儀上測定光密度（optical density，OD）值，按公式計算相對增殖率（relative growth rate，RGR）：RGR=試驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%。

1.3 數據處理

用計算機統計軟件包Statistica對數據作Students’t檢驗，數據采用（Mean±SEM）表示，確定差異顯著性。

2 結果

2.1 直接接觸法

共培養24 h后，0.125 g/皿、0.25 g/皿和0.5 g/皿三組的L929細胞能貼壁于膜上生長，細胞形態呈長條梭形或不規則多邊形，1 g/皿和2 g/皿的細胞變圓或裂解死亡，未能貼附生長。隨著培養時間的增加，0.125 g/皿、0.25 g/皿和0.5 g/皿三組的L929細胞大量增殖，共培養72 h后，0.125 g/皿和0.25 g/皿兩組視野內細胞數量差別不大，0.5 g/皿組的細胞數量較之前兩組較少，1 g/皿和2 g/皿的細胞已死亡殆盡，見圖1。

2.2 MTT（四唑鹽）比色法

表1為各浸提比例浸提液的細胞相對增殖率。結果顯示：隨著浸提比例的增加，細胞的相對增殖率越來越低。

3 討論

液體創可貼屬于生物成膜型生物制品，將其噴涂或涂抹在創面能快速干燥并形成透氣、防水、柔軟且有彈性的保護膜。它具有隔菌、透氣、防水、使用方便、易于觀察傷口情況及促進傷口恢復等特點[8]。不含藥物的液體創可貼屬于醫療器械范疇，按照國家醫療器械的分類規則，其屬于Ⅱ類醫療器械產品[9]。國家對Ⅱ類醫療器械產品是進行注冊管理的。在現行的國家標準以及行業標準中，還沒有針對液體創口貼的相關標準。目前其在注冊申請時都是依據企業提供的產品技術要求或是委托書進行檢測，沒有統一的行業標準。隨著此類產品申請注冊企業的增多，為保證其使用的安全性，建立合適的檢驗方法體系進行生物學評價是必要的步驟。而體外細胞毒性試驗是生物學評價中不可或缺的一項試驗，是評價醫療器械產品毒性反應的一項重要指標。

試驗中選擇了直接接觸法和浸提液法對液體創口貼的細胞毒性進行了檢測。在進行浸提液制備時，如果將液體創口貼直接加入細胞培養液制備浸提液，會形成絮狀物，無法進行試驗。考慮到它的有效使用狀態為成膜制品，故在進行試驗時都是將其先晾干成膜，再進行檢測。

GB/T16886.5-2003標準中規定了直接接觸法的試驗步驟：是將細胞培養到近匯合的狀態，再將樣品置于細胞上方，共培養后觀察樣品下方以及周圍細胞生長狀態，進行分類分級。本試驗中由于樣品成膜后較輕，如果將膜置于細胞上方會漂浮在培養液中，無法固定，從而無法進行后期觀察。故在進行本試驗時，是將液體創口貼直接成膜貼附于培養皿中，再將細胞懸液接種于培養皿中。結果顯示：0.125 g/皿、0.25 g/皿和0.5 g/皿三組的L929細胞能貼壁于膜上生長，且隨著共培養時間的增加，視野內的細胞數量也增加，這與MTT比色法的結果一致。1 g/皿和2 g/皿組在直接接觸法中細胞在24 h未能貼附生長就已死亡殆盡，但在MTT比色法中這兩組細胞增殖率分別為54.6%、40.4%。這兩組結果直接接觸法的細胞毒性高于MTT比色法，分析原因可能是MTT比色法中細胞是貼附生長后再加的浸提液，因而浸提液中的毒性物質對細胞的增殖影響較大，對細胞的貼壁影響不大；直接接觸法是細胞懸液直接加入到膜上，樣品釋放的毒性物質使得細胞不能貼壁，也就不能增殖生長。

表1 各浸提比例浸提液的細胞相對增殖率

圖1 L-929細胞與各比例的液體創口貼膜共培養24 h、48 h和72 h后的細胞形態（倒置相差顯微鏡，×400）

綜合這兩種方法的檢測結果，這兩種細胞毒性檢測方法都能適用于液體創口貼的檢測。但由于這兩種檢測方法的原理不同，對檢測結果也有很大的影響。而且樣品濃度的選擇也會直接影響檢測的結果。此外，國內液體創可貼尚未有國家標準和行業標準進行質量控制，都是企業內部技術要求，產品質量參差不齊，需要制定相關行業標準進行管理控制。現行的國際、國家標準只是對醫療器械生物學評價給出了籠統的指導原則，并沒有實際的針對性[10]。因此在實際的醫療器械檢測過程中，需要我們檢測人員根據醫療器械產品的特性，探尋出合理有效地檢測方法，以期達到有效地評價醫療器械產品細胞毒性的目的。

[1] GB/T16886．1-2011． 醫療器械生物學評價第1部分風險管理過程中的評價與試驗[S]． 2011．

[2] 高靜賢，王莎莎，金夢，等． 醫用超聲耦合劑體外細胞毒性檢測的探討[J]． 中國醫療器械雜志，2013，37（3）：210-212．

[3] GB/T16886．5-2003． 醫療器械生物學評價第5部分體外細胞毒性試驗[S]． 2003．

[4] ISO 10993-5：2009． Biological evaluation of medical devices-Part 5：Test for in vitro cytotoxicity[S]． 2009．

[5] 奚廷斐． 醫療器械生物學評價[M]． 中國標準出版社，2012：96-107．

[6] GB/T 16886．12-2005． 醫療器械生物學評價第12部分:樣品制備與參照樣品[S]． 2005．

[7] ISO 10993-12：2012． Biological evaluation of medical devices -Part 12：Sample preparation and reference materials[S]． 2012．

[8] 劉海霞，張愛軍，張林． 液體創可貼的研究進展[J]． 中國醫藥科學，2016，6（4）：28-31．

[9] 國家食品藥品監督管理總局． 醫療器械分類規則（國家食品藥品監督管理總局令第15號）[S]． 2015．

[10] 孫皎． 醫療器械的生物學評價與風險探討[J]． 中國醫療器械雜志，2006，30（5）：386-387，382．

Discuss the Vitro Cytotoxicity Test of Liquid Bandage

YAN Xiaoli1GAO Jingxian1LIU Qian1WANG Shasha1YANG Yumin21 Jiangsu Province Medical Instrument Testing Institute, Nanjing Jiangsu 210022, China; 2 Key Laboratory for Nerve Regeneration, Nantong University, Nantong Jiangsu 226000, China

Objective The cytotoxicity of liquid bandage was tested by MTT assay and direct contact. Methods Considering the using condition of liquid bandage, the sample was prepared to make extraction on the film formation. Results The results of the two tests were consistent at 0.125 g/plate, 0.25 g/plate and 0.5 g/plate. At 1 g/plate and 2 g/plate, significant different appeared in the tests. Conclusion The experimental condition and the preparative method of extraction should be determined.

liquid bandage; cytotoxicity; direct contact test; MTT assay

R446

A

1674-9316（2017）04-0112-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．04．071

國家自然科學基金課題（81371687）

1 江蘇省醫療器械檢驗所，江蘇 南京 210022；2 南通大學神經再生重點實驗室，江蘇 南通 226000