鼠李糖乳桿菌與嗜熱鏈球菌復配發酵乳的工藝優化

(新希望乳業控股有限公司產品研發中心，成都610063)

鼠李糖乳桿菌與嗜熱鏈球菌復配發酵乳的工藝優化

曾麗萍，王欣璐，李啟明，聶遠洋

(新希望乳業控股有限公司產品研發中心，成都610063)

通過研究分離自新疆傳統酸駱駝奶中的鼠李糖乳桿菌grx10的發酵特性，將鼠李糖乳桿菌grx10與不同發酵特性的嗜熱鏈球菌復配制作發酵乳，優化了鼠李糖乳桿菌grx10的最適接種量和最適發酵溫度，評價了復配發酵乳的發酵特性、質構特性和感官品質，并測定了其乳酸菌活菌數。結果表明，優化后的發酵工藝參數為：鼠李糖乳桿菌grx10與嗜熱鏈球菌st447復配，鼠李糖乳桿菌grx10的最適接種量為4%，最適發酵溫度為42℃，發酵時間為5 h，按照此工藝制得的發酵乳的總活菌數為1.32×109mL-1，鼠李糖乳桿菌grx10的活菌數為8.40×108mL-1，且口感、風味和整體品質俱佳，能同時滿足生產工藝及消費者對產品的需求。

發酵乳；工藝優化；鼠李糖乳桿菌；嗜熱鏈球菌

0 引言

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnose)是一種能夠利用發酵性糖類產生乳酸的益生菌，具有抑制腸道中有害菌生長、降低血清膽固醇、提高免疫力等生理功能。

筆者實驗室就從新疆傳統酸駱駝奶中分離篩選到一株鼠李糖乳桿菌，體外實驗和動物實驗證明該菌株能耐受胃酸和膽汁酸，具有顯著的降低血清膽固醇功效。但研究表明，只有當每天攝取的益生菌數量達到108～109才具有保健功效，而大多益生菌的發酵特性差不利于高活菌數益生菌產品的工業化和市場推廣。本研究對新疆酸駱駝奶中篩選到的鼠李糖乳桿菌的發酵特性進行研究，優化發酵工藝，以期在不添加食品添加劑的條件下得到一款鼠李糖乳桿菌活菌數達到保健要求且品質穩定、良好口感的發酵產品，為進一步推廣應用奠定基礎。

1 實驗

1.1菌種

鼠 李 糖 乳 桿 菌 grx10（Lactobacillus rhamnosus grx10），一株分離自新疆傳統乳制品中具有降膽固醇功效的專利菌種（專利號：CN101328470），由河北一然生物科技有限公司代加工成凍干菌粉；嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）st079，st447，st071，st328，st338，st077，st073，st446。

1.2主要試劑與儀器

MRS培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，CH3COONa 5 g，K2HPO42 g，MgSO4· 7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.2 g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1 000 mL，調pH值至6.2～6.4。

全自動生長曲線分析儀，物性測試儀（TA.XTPlus），恒溫培養箱（SPX-150BSH-II）、超凈工作臺（SW-CJ-2FD）、pH計（梅特勒FE20）等。

1.3方法

1.3.1 接種菌液的制備與活化

分別稱取鼠李糖乳桿菌grx10凍干菌粉2 g至50 mL 40℃滅菌水中和嗜熱鏈球菌凍干菌粉0.25 g至100 mL 40℃滅菌水中，搖勻并孵育10 min制成接種菌液。發酵接種量按接種的滅菌乳體積計算。

1.3.2 益生菌發酵乳制備工藝流程

配料（原料乳預熱至55℃加入質量分數為8%白砂糖和1.5%乳清蛋白粉充分溶解）→均質（20～25 MPa）→殺菌（90℃，10～15 min）→冷卻至37℃→接種→發酵至凝乳（發酵溫度為37℃，發酵終點pH值為4.5左右）→后熟（4℃，12 h）。所用菌種和接種量如表1所示。

表1 實驗用菌種

1.3.3 鼠李糖乳桿菌grx10單株菌發酵性能測定

生長曲線測定：取1.3.1制備的鼠李糖乳桿菌grx10接種液按3%的接種量接入已滅菌的MRS培養基中，混勻。在Bioscreen全自動生長曲線分析儀的檢測孔板中，每孔加入300 μL上述已接種培養基，并做三個重復孔[8]，將已加樣的檢測孔板置于Bioscreen全自動生長曲線分析儀中，37℃靜置培養20 h，每2 h自動掃描讀取每個加樣孔的A600值。

酸化曲線測定：將1.3.1制備的鼠李糖乳桿菌grx10接種液按3%的接種量接入已滅菌的酸奶發酵基料中，混勻后分裝于10個滅菌瓶中，37℃下靜置發酵，每隔2 h測定其pH值和滴定酸度，以培養時間為橫坐標，pH值和滴定酸度為縱坐標，繪制鼠李糖乳桿菌grx10的生長曲線。

1.3.4 與鼠李糖乳桿菌grx10復配發酵的最適嗜熱鏈球菌的篩選

將1.3.1制備的鼠李糖乳桿菌grx10和嗜熱鏈球菌接種液按表1分別接入已滅菌的酸奶發酵基料中，混勻后在37℃下靜置發酵，至pH值達到4.5時終止發酵并記錄凝乳時間，然后置于4℃下后熟12 h，進行pH值和滴定酸度測定、質構測定、感官評定并在光學顯微鏡下觀察乳酸菌形態，根據結果篩選最優發酵組合。

1.3.5 鼠李糖乳桿菌grx10最適接種量的優化

分別稱取4 g鼠李糖乳桿菌grx10凍干菌粉溶于50 mL滅菌水中，搖勻制備成接種液，同1.3.1制備的嗜熱鏈球菌接種液一起接種于已滅菌的酸奶發酵基料中，混勻后在37℃下靜置發酵，至pH值達到4.5時終止發酵并記錄凝乳時間，然后置于4℃下后熟12 h，進行pH值和滴定酸度測定、質構測定、感官評定并在光學顯微鏡下觀察乳酸菌形態，根據結果確定最適的鼠李糖乳桿菌grx10接種量。

1.3.6 最適發酵溫度的優化

按最適接種量取鼠李糖乳桿菌grx10與嗜熱鏈球菌一起接種于已滅菌的酸奶發酵基料中，混勻后在37℃下靜置發酵，至pH值達到4.5時終止發酵并記錄凝乳時間，然后置于4℃下后熟12 h，進行pH值和滴定酸度測定、質構測定、感官評定并在光學顯微鏡下觀察乳酸菌形態，根據結果確定最適發酵溫度。

1.3.7 發酵乳酸度和pH值的測定

采用氫氧化鈉直接滴定法測定酸度，用pH計測定pH值[9]。

1.3.8 發酵乳質構測定

采用物性測試儀測定發酵乳的質構特性，使用P0.5探頭（直徑0.5英寸的圓柱形探頭），測前速度0.5 mm/s，測后速度10.0 mm/s，感受力10 g，返回距離30 mm，測定樣品的黏度、堅實度和稠度指標。樣品均重復測定三次[10-12]。

1.3.9 感官評定方法

感官評定小組由10名具有乳制品感官評定知識背景的人組成，以表觀特性、氣味、質地、風味、酸甜比作為主要評價指標。組織、狀態測定：取適量樣品置于潔凈的平板中，在自然光下觀察色澤、組織狀態及切面；風味、口感測定：先聞氣味，溫開水漱口后品嘗樣品[13]。

1.3.10 菌落計數

參照國標GB 478935－2010的方法檢測發酵乳中的乳酸菌活菌數。

2 結果與討論

2.1鼠李糖乳桿菌grx10單株菌的生長曲線和酸化曲線

鼠李糖乳桿菌grx10在培養2 h后進入對數期，在2～10 h內，菌液OD600nm值迅速升高。從12 h開始，菌體培養進入穩定期，鼠李糖乳桿菌grx10的生長曲線如圖1所示。

圖1 鼠李糖乳桿菌grx10的生長曲線

發酵實驗結果表明，鼠李糖乳桿菌grx10的酸化速度比較緩慢，從4 h開始，酸度才有開始明顯提高，在4～12 h內酸度上升較快，到12 h時酸度達到75°T，鼠李糖乳桿菌grx10的酸化曲線如圖2所示。

圖2 鼠李糖乳桿菌grx10的酸化曲線

由圖1與圖2的結果發現，當鼠李糖乳桿菌grx10的生長進入對數期時其酸度也明顯開始上升，鼠李糖乳桿菌grx10的生長曲線與酸化曲線的變化基本一致。分析原因可能是隨著鼠李糖乳桿菌grx10的生長繁殖，代謝產物（如乳酸等）不斷積累，整個發酵體系的酸度也隨之升高[14]。

2.2不同嗜熱鏈球菌與鼠李糖乳桿菌grx10復配發酵

不同嗜熱鏈球菌與鼠李糖乳桿菌grx10復配發酵后樣品的凝乳時間、酸度、pH、感官指標如表2所示。方差分析結果表明，鼠李糖乳桿菌grx10與嗜熱鏈球菌進行復配發酵，凝乳時間差異顯著，其中純鼠李糖乳桿菌grx10發酵時間最長達12 h，與嗜熱鏈球菌進行復配發酵后，發酵時間顯著縮短（P＜0.05），與不同的嗜熱鏈球菌復配發酵的時間也存在差異，其中I組的發酵時間最短，但滴定酸度、凝乳pH值均差異不顯著（P＞0.05）。表2中，發酵產品的感官指標均存在明顯差異，其中A、B、E、F、H組的產品均質地粗糙松散，C、D、G均風味平淡無特色，只有I組質地細膩、口感柔和且有明顯的grx10發酵風味。

不同嗜熱鏈球菌與鼠李糖乳桿菌grx10復配發酵酸奶的質構特性結果如表3所示。表3中，各組樣品的硬度從大到小為B＞D＞H＞C＞I＞E＞F＞G＞A，即純鼠李糖乳桿菌grx10發酵樣品的硬度最小，與嗜熱鏈球菌復配發酵樣品硬度均明顯提高，且B、C、D、H組均達到顯著水平（P＜0.05）；各組的稠度從大到小為D＞B＞C＞H＞I＞E＞F＞G＞A，即純鼠李糖乳桿菌grx10發酵樣品的稠度最小，除了F、G兩組其于組的稠度均較A組顯著提高（P＜0.05）。黏聚性是用于模擬樣品的內部粘合力，各組的黏聚性大小為D＞C＞G＞I＞B＞H＞E＞F＞A，即純鼠李糖乳桿菌grx10發酵樣品的黏聚性最小，除了F組其于組樣品的黏聚性均顯著高于A組（P＜0.05）；黏性是模擬探頭與樣品接觸時用于克服兩者表面間吸引力所需工作，即反映了樣品的黏著性，各組的黏性指數大小為D＞C＞B＞I＞G＞H＞E＞F＞A，即A組的黏性指數最小，且顯著小于其于組（P＜0.05）。

表2 不同嗜熱鏈球菌與鼠李糖乳桿菌grx10復配發酵結果

表3 不同嗜熱鏈球菌與鼠李糖乳桿菌grx10復配發酵酸奶的質構特性

綜合各組的發酵特性、感官品評指標以及發酵乳質構特性指標發現，雖然純種鼠李糖乳桿菌grx10發酵時間長、風味難以讓人接受、質構指標也差，但是與嗜熱鏈球菌復配發酵后，發酵特性、風味與質構均得到了顯著改善，不同組之間也存在明顯差異。各組雖發酵時間均顯著縮短，但是B、E、F、H組均口感粗糙、質地松散且質構大多指標均差，C、D組雖硬度、稠度、黏聚性和黏性指數均高于明顯高于其它組，但是風味平淡且太粘稠。分析原因可能是，鼠李糖乳桿菌grx10發酵速率慢，產胞外多糖少，發酵乳黏度低有顆粒感，C、D、I組的嗜熱鏈球菌能產生較多胞外多糖，影響酪蛋白間的相互鏈接方式，對酪蛋白微球立體網狀結構的構建產生影響，進而影響凝膠結構的形成，改善了發酵乳的質地，同時鼠李糖乳桿菌grx10與嗜熱鏈球菌能協同生長，從而縮短了發酵時間。綜合以上結果，與鼠李糖乳桿菌grx10復配發酵益生菌酸奶的最適菌種為嗜熱鏈球菌st447。

2.3鼠李糖乳桿菌grx10最適接種量的確定

選用嗜熱鏈球菌st447與鼠李糖乳桿菌grx10進行復配發酵，不同接種量發酵的凝乳時間、酸度、pH值、感官指標如表4所示。方差分析表明，接種量對凝乳時間有顯著影響，其中A組的凝乳時間顯著長于B組和C組（P＜0.05），但是B組和C組無差異；滴定酸度、凝乳pH值均差異不顯著（P＞0.05），三個樣品的口感差異不顯著，均質地細膩、口感順滑，但是B組鼠李糖乳桿菌grx10發酵風味更柔和且優于A組和C組，A組的風味太平淡而C組的鼠李糖乳桿菌grx10發酵風味太濃烈。

表4 不同接種量的鼠李糖乳桿菌grx10發酵結果

不同接種量鼠李糖乳桿菌grx10發酵乳的質構特性結果如表5所示。由表5可以看出，接種量對發酵乳質構無明顯影響，均未達到顯著水平（P＞0.05）。

表5 不同接種量的鼠李糖乳桿菌grx10發酵乳的質構特性

綜合各組的發酵特性、感官品評指標以及發酵乳質構特性指標發現，鼠李糖乳桿菌grx10接種量的增加能縮短發酵時間，對口感和質構指標無顯著影響。但是，隨著鼠李糖乳桿菌grx10添加量的增加能明顯提高鼠李糖乳桿菌grx10的發酵風味，不過當接種量為6%時其發酵風味太濃烈，使得樣品整體風味不太柔和。綜合以上結果，鼠李糖乳桿菌grx10的最適接種量為4%。

2.4最適發酵溫度的確定

接種嗜熱鏈球菌st447與鼠李糖乳桿菌grx10進行復配發酵，不同溫度下發酵的凝乳時間、酸度、pH值、感官指標如表6所示。方差分析結果表明，在42，37，33℃下復配發酵，凝乳時間差異極顯著（P＜0.01），凝乳時滴定酸度、pH值均差異不顯著（P＞0.05）。但發酵產品感官存在明顯差異，隨著發酵溫度的降低黏稠度逐漸增加，鼠李糖乳桿菌grx10的發酵風味也逐漸變濃，但是42℃時風味最柔和且還有濃濃的奶香。

不同發酵溫度下的復配發酵乳質構特性如表7所示。由表7可以看出，溫度除了對發酵產品的黏聚性沒顯著影響外，對硬度、稠度、黏性指數均存在顯著影響（P＜0.05），但37℃與33℃除了稠度達到顯著差異（P＜0.05），其他指標均無顯著差異（P＞0.05），且硬度、稠度和黏性指數均隨溫度的降低而減小。

綜合各組的發酵特性、感官品評指標以及發酵乳質構特性指標發現，提高發酵溫度能有效縮短發酵時間，改善質構特性，且在42℃時風味最佳。綜合以上結果，復配發酵乳的最適發酵溫度為42℃。

2.5最終發酵產品的活菌數測定

表6 不同溫度下的復配發酵乳發酵結果

表7 不同發酵溫度對復配發酵乳質構特性的影響

鼠李糖乳桿菌grx10與嗜熱鏈球菌按4%接種量在42℃下復配發酵，產品活菌數計數結果見圖3，其總活菌數為1.32×109/mL-1，嗜熱鏈球菌的活菌數為4.80×108/mL-1，鼠李糖乳桿菌grx10的活菌數為8.40×108/mL-1。由此可見，經工藝優化后，復配發酵乳的益生菌活菌數已達到起保健功效的要求。

圖3 復配發酵乳產品最終活菌數

3 結論

本研究對新疆傳統的酸駱駝奶中分離出的一株具有降低血清膽固醇功效的鼠李糖乳桿菌grx10的發酵特性進行研究發現，由于其發酵時間長、產酸慢，采用純種發酵其口感和風味差等原因，極不利于該菌株的工業化應用和市場推廣。因此通過研究鼠李糖乳桿菌grx10與不同發酵特性的嗜熱鏈球菌復配發酵，優化了鼠李糖乳桿菌grx10的最適接種量和最適發酵溫度，最終確定其發酵工藝條件為：鼠李糖乳桿菌grx10與嗜熱鏈球菌st447復配，鼠李糖乳桿菌grx10的最適接種量為4%，發酵溫度為42℃，發酵時間為5 h，最終發酵產品總活菌數為1.32×109/mL-1，鼠李糖乳桿菌grx10的活菌數為8.40×108/mL-1，通過感官分析并結合物性測試儀測定產品的質構特性等，表明復配發酵乳的口感、風味和整體品質俱佳，既達到保健功效作用又達到市售酸奶品質、口感要求，并且配料簡單、無添加任何食品添加劑，滿足了消費者對健康食品的需求。

[1]苑社強,谷新晰,李晨,等.鼠李糖乳桿菌純種發酵大豆乳工藝研究[J].中國食品學報,2013,13(7):19-24.

[2]ZOCCO M A,VERME L Z D,CREMONINI F,et al.Efficacy of Lactobacillus,GG in maintaining remission of ulcerative colitis[J].Alimentary Pharmacology&Therapeutics,2006,23(11):1567-1574.

[3]MISRA S,SABUI T K,PAL N K.A randomized controlled trial to evaluate the efficacy of lactobacillus GG in infantile diarrhea[J].Journal of Pediatrics,2009,155(1):129-32.

[4]HOJSAK I,SNOVAK N,ABDOVIC S,et al.Lactobacillus,GG in the prevention of gastrointestinal and respiratory tract infections in children who attend day care centers:A randomized,double-blind, placebo-controlled trial[J].Clinical Nutrition,2010,29(3):312-316.

[5]張明,代青梅,任發政,等.鼠李糖乳桿菌乳飲料發酵工藝[J].食品與發酵工業,2015,41(7):104-108.

[6]馬強,呂嘉櫪,趙維俊.影響益生菌奶片壓制中活菌數因素的研究[J].中國乳品工業,2011,39(11):13-15.

[7]LOURENS-HATTINGH A,VILJOEN B C.Growth and survival of a probiotic yeast in dairy products[J].Food Research International, 2001,34(9):791-796.

[8]劉玉慶,胡明,劉煥奇,等.表征抗菌藥物抑菌動力學的等效線藥敏試驗方法[J].中國科學生命科學,2015(6):614-622.

[9]胡豆,林鳳英,梁鉆好,等.不同菌種組合對酸奶品質的影響研究[J].飲料工業,2015(2):13-16.

[10]TRANCOSO-REYES N,GUTIERREZ-MENDEZ N,SEPULVEDA D R,et al.Assessing the yield,microstructure,and texture properties of miniature Chihuahua-type cheese manufactured with a phospholipase A 1,and exopolysaccharide-producing bacteria[J]. Journal of Dairy Science,2014,97(2):598-608.

[11]陳瑋,常忠義,高紅亮,等.不同發酵劑生產的酸奶感官評定和TPA質構分析[J].中國釀造,2012,31(1):193-195.

[12]張悅,葛武鵬,袁亞娟,等.牛、羊乳酸乳發酵過程中質構學特性的變化規律[J].食品科學,2013,34(17):82-86.

[13]李俊芳,康靈芝.酸奶的感官與理化特性和乳酸菌活菌數的相關性[J].食品研究與開發,2015(2):17-20.

[14]郭本恒.益生菌[M].北京:化學工業出版社,2004:17-25.

Technological optimization of mixed fermented milk prepared by Lactobacillus rhamnosus and Streptococcus thermophiles

ZENG Liping,WANG Xinlu,LI Qiming,NIE Yuanyang
(Product Research Center,New Hope Dairy Holdings co.LTD,Chengdu 610063,China)

The aim of this experiment is to evaluate the mixed fermented milk which is fermented by Streptococcus thermophilus with different fermentation characteristics and Lactobacillus rhamnosus named grx10 which was isolated from camel yogurt in Xinjiang.By optimizing inoculation and fermentation temperature,we measured fermentation characteristics,texture properties,sensory quality,and its viable count of Lacticacid bacteria.The results showed that the optimal inoculation of Lactobacillus rhamnosus were 4%when it was fermented with Streptococcus thermophilus,the fermentation temperature was 42℃ and fermentation time was 5 h,the number of viable Lactobacillus rhamnosus was 8.40×108/ mL-1.Moreover,sensory evaluation results showed that,the taste and flavor of grx10 yogurt was well,which can satisfy both production and consumer’s demand.

fermented milk;technological optimization;Lactobacillus rhamnosus;Streptococcus thermophilus

TS252.54

A

1001-2230（2017）02-0047-04

2016-06-07

國家科技支撐計劃課題(2012BAD12B04)；四川省國際科技合作與交流研究計劃(2016HH0056)。

曾麗萍（1989-），女，碩士，從事乳品微生物方面的研究。

聶遠洋