CpG ODN聯合重組乳酸乳球菌鼻內免疫BALB/c小鼠的佐劑效應

王振華，曾憲垠

(1．成都農業科技職業學院，四川溫江611130; 2．四川農業大學生命理學院原子能應用實驗室，四川雅安625014)

CpG ODN聯合重組乳酸乳球菌鼻內免疫BALB/c小鼠的佐劑效應

王振華1，曾憲垠2

(1．成都農業科技職業學院，四川溫江611130; 2．四川農業大學生命理學院原子能應用實驗室，四川雅安625014)

本試驗初次建立了CpG ODN聯合重組乳酸乳球菌滴鼻免疫BALB/c小鼠模型。結果得出CpG ODN佐劑協同重組菌抗原組血清中抗PRRSV特異性抗體IgG和呼吸道黏膜抗體s-IgA均高于單獨重組菌組(P＞0．05)和單獨佐劑組(P＜0．01)，佐劑CpG ODN協同重組菌抗原組的Th1型細胞因子IL-2、IFN-γ及黏膜淋巴因子IL-5的活性高于單獨抗原組(P＞0．05)及單獨佐劑組(P＜0．01)。試驗結果說明CpG ODN作為佐劑與重組菌鼻腔免疫小鼠后，可以提高重組菌誘導的黏膜免疫反應和Th1細胞參與的系統免疫反應，為研究安全有效的重組菌黏膜疫苗奠定了基礎。

CpG ODN;重組乳酸乳球菌;鼻腔免疫

隨著免疫學的深入發展，黏膜免疫以其獨特的優勢在抵抗感染方面占有重要地位，在進行疫苗研究時，新型佐劑的作用也受到更多重視，比較理想的黏膜佐劑應高效、安全，能激活黏膜免疫系統，在其存在的情況下抗原經黏膜供給可引發抗原特異性系統免疫和黏膜免疫應答，同時能避免黏膜免疫耐受的產生。CpG ODN(CpG oligodeoxynucleotide，CpG ODN)是人工合成的含有CpG基序的寡聚脫氧核苷酸，模擬了細菌DNA結構，可激活T細胞、B細胞、NK細胞等，產生大量的多種細胞因子，與抗原蛋白共同免疫，具有較強的佐劑效應，能同時增強抗原特異性體液免疫應答和細胞免疫應答，尤其是對細胞免疫應答具有更突出的增強作用。目前研究資料顯示，CpG ODN經鼻腔免疫接種小鼠是一種有效的黏膜佐劑，既能增強黏膜抗原黏膜免疫應答，又可以增強系統免疫應答(包括體液免疫和細胞免疫)的功能，促進Thl/Th2型免疫反應，另外臨床實驗還證明了CpG ODN對于人類具有安全性［1－5］。

本試驗初次建立了CpG ODN聯合重組乳酸乳球菌滴鼻免疫BALB/c小鼠模型，評價其佐劑效應。

1 試驗材料

1．1 實驗動物BALB/c小鼠，雌性，體重18～22 g，6～8周齡，購自華西試驗動物中心。

1．2 佐劑及免疫原佐劑:CpG ODN(5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’)，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

免疫原:重組乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900－M/PRRS(本實驗室構建并保存)，菌株為乳酸乳球菌NZ3900，表達載體為pNZ8149，表達蛋白為豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF6基因片段(即M蛋白)。

1．3 主要試劑HRP-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗鼠IgA，購自美國Sigma公司;細胞因子檢測試劑盒為基因美公司產品。

2 試驗方法

2．1 實驗動物的選取及處理試驗將BALB/c小鼠90只隨機分為3組(n=30)，分別為重組菌對照組(組Ⅰ)、佐劑+重組菌試驗組(組Ⅱ)和佐劑對照組(組Ⅲ)具體見表1。各組實驗動物被連續免疫三次，間隔7天，每次連續免疫三天(即:1 d，2 d，3 d，11 d，12 d，13 d，21 d，22 d，23 d)［6］。

表1 實驗動物分組及處理

2．2 免疫用免疫原的制備將重組菌PNZ8149/ NZ3900－M/PRRS誘導后離心收集菌體，用0.01 mol/L無菌PBS洗滌懸浮，使細菌含量為1×1011CFU/mL，并將重組菌PNZ8149/NZ3900－M/PRRS與免疫佐劑充分乳化，佐劑劑量為10 μg/只。

2．3 樣品采集及指標檢測

2．3．1 呼吸道黏膜s-IgA檢測分別于最后一次免疫后0 d、7 d、14 d、21 d、28 d處死小鼠6只，取肺臟，收集沖洗液，采用間接ELISA方法檢測呼吸道黏膜s-IgA水平。

2．3．2 血清中特異抗體IgG檢測分別于最后一次免疫后0 d、7 d、14 d、21 d、28 d眼眶靜脈采集6只小鼠血液，收集血清，采用間接ELISA方法檢測血清特異性抗體。

2．3．3 細胞因子檢測分別于最后一次免疫后14 d，處死后取鼠脾臟，制備脾臟淋巴細胞懸液，收集脾臟淋巴細胞培養上清液，用ELISA試劑盒檢測細胞因子IL-2、IL-4、IL-5及IFN-γ的活性。

3 結果分析

3．1 血清IgG抗體由表2得出，佐劑+重組菌小鼠血清中特異性IgG抗體含量高于重組菌對照組(P＞0．05)，及佐劑對照組組(P＜0．01)。結果表明，佐劑CpG ODN通過鼻腔免疫可以增加重組乳酸乳球菌體液免疫水平。

3．2 呼吸道黏膜s-IgA由表3可出，在整個免疫測定時間內，佐劑+重組菌組小鼠呼吸道黏膜中s-IgA含量高于單獨佐劑組(P＜0．01)和單獨重組菌組(P＞0．05)。同時所有組小鼠黏膜中的特異性s-IgA都處于平穩狀態，可能是檢測時間比較晚或檢測周期相對較短導致。表明黏膜免疫佐劑CpG ODN經鼻腔免疫接種可以提高重組菌刺激呼吸道黏膜產生s-IgA的含量。

3．3 細胞因子佐劑CpG ODN聯合重組菌PNZ8149/NZ3900－M/PRRS鼻內免疫小鼠后，小鼠脾臟細胞懸液中Th1型細胞因子IL-2、IFN-γ和黏膜淋巴因子IL-5的活性高于重組菌PNZ8149/ NZ3900－M/PRRS單獨免疫組(P＞0．05);Th2型細胞因子IL-4水平在各組之間差異不顯著(P＞0.05)(見表4)。結果表明，佐劑CpG ODN通過鼻腔免疫能夠提高重組菌的抗原應答。

4 討論

佐劑CpG ODN是一種有效的黏膜佐劑，經鼻腔免疫接種小鼠既能增強黏膜抗原黏膜免疫應答，又可以增強系統免疫應答(包括體液免疫和細胞免疫)的功能，促進Thl/Th2型免疫反應［1－5］。1998年，Moldoveanu等以CpG佐劑協同滅活流感病毒抗原滴鼻免疫小鼠，測得血清中IgG和鼻腔、生殖道黏膜中s-IgA的滴度比單獨抗原組顯著增高，首次證明CpG具有黏膜佐劑作用;Kodama等以CpG ODN為佐劑，與抗原P6聯合鼻內免疫小鼠，結果血清和鼻腔沖洗液中均檢出高滴度的IgG和s-IgA［7］;史彤等以幽門螺桿菌超聲粉碎物作為抗原，以CpG ODN作為佐劑，得出CpG ODN作為鼻黏膜免疫佐劑激活Thl型免疫應答和IFN-γ的分泌在抗感染中起著重要作用［8］。石蓉等將弓形蟲可溶性速殖子抗原(STAg)與不同劑量(1 μg、5 μg、10 μg)的CpG ODN聯合滴鼻免疫小鼠，得出CpG ODN可作為STAg的鼻腔免疫的黏膜佐劑［9］;張曉文等在H5N2型禽流感滅活抗原中添加佐劑CpG ODN，證實CpG ODN佐劑能夠增加羅曼公雞呼吸道s-IgA分泌細胞面積和IgG分泌細胞數量，提高局部呼吸道體液免疫應答水平［10］。Kumar等評價了CpG ODN佐劑對鼠源瘧原蟲19 kD膜表面蛋白表達抗原的免疫增強作用，結果顯示CpG ODN主要產生Thl型免疫反應［11］。本研究在目前的研究基礎上，采用10 μg的CpG ODN作為佐劑，以重組菌PNZ8149/NZ3900－M/ PRRS為抗原，鼻腔免疫小鼠，佐劑CpG ODN協同重組菌經鼻腔免疫小鼠能提高抗原誘導的黏膜免疫和h1型細胞介導的特異性免疫反應，為黏膜免疫的廣泛應用提供了良好基礎。

表2 佐劑CpG ODN聯合重組菌鼻內免疫小鼠后血清中特異性IgG檢測結果

表2 佐劑CpG ODN聯合重組菌鼻內免疫小鼠后血清中特異性IgG檢測結果

注:同列肩標不同字母表示組間差異顯著(P＜0．05)，相同字母表示組間差異不顯著(P＞0．05);大寫字母表示(P＜0．01)水平，小寫字母表示(P＜0．05)水平，下表同

表3 佐劑CpG ODN聯合重組菌鼻內免疫小鼠后呼吸道黏膜特異性s-IgA檢測結果

表3 佐劑CpG ODN聯合重組菌鼻內免疫小鼠后呼吸道黏膜特異性s-IgA檢測結果

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表4 佐劑CpG ODN聯合重組菌鼻內免疫小鼠脾細胞懸液分泌的細胞因子檢測結果

表4 佐劑CpG ODN聯合重組菌鼻內免疫小鼠脾細胞懸液分泌的細胞因子檢測結果

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5 結論

CpG ODN佐劑協同重組乳酸乳球菌鼻腔免疫小鼠后，具有明顯的黏膜佐劑的效應，由此表明，CpG ODN作為重組乳酸乳球菌疫苗免疫佐劑的有效性，為病原體疫苗提供了新的免疫策略。

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［5］Zhang L，Tian X，Zhou F．Intranasal administration of CpG oligonucleotides induces mucosal and systemic Type 1 immune responses and adjuvant activity to porcine reproductive and respiratory syndrome killed virus vaccine in piglets in vivo［J］．International immunopharmacology，2007，7(13):1732-1740．

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［8］史彤，劉文忠，蕭樹東．CpG寡核苷酸可作為幽門螺桿菌疫苗的佐劑［J］．中華消化雜志，2003，23(4):233-236．

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The Adjuvant CpG ODN Enhance the Recombinant Lactococcus lactis Antigen Elicited Mucosal and Systemic Immunity in Mice by Intranasal Immunization

WANG Zhen-hua1，ZENG Xian-yin2
(1．Department of Animal and Veterinary Science，Chengdu Vocational College of Agricultural Science and Technology，Wenjiang 611130，China;2．Isotope Research Laboratory，College of Life and Basic Sciences，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China)

In order to evaluate the effect of CpG ODN adjuvant，we investigated whether co－administration intranasally of the antigen of the recombinant Lactococcus lactis(L．1actis)expressing ORF6 gene of PRRSV and the adjuvant CpG ODN can enhance mucosal and systemic immune responses in mice．The results showed that the level of mucosal s－IgA in lung lavage fluid and IgG in serum of the mice immunized with the recombinant L．1actis plus adjuvant CpG ODN significantly increased compared with the control group immunized with the recombinant L．1actis plus(P＞0．05)and adjuvant CpG ODN alone(P＜0．01)．Interestingly，The activity of Th1－type cytokines IL-2，IFN-γ and mucosal lymphokine IL-5 in splenocytes were higher than those of the control group immunized with the recombinant L．1actis plus(P＞0．05)and adjuvant CpG ODN alone(P＜0．01)．Taken together，the results demonstrate that intranasal delivery of CpG ODN as a mucosal adjuvant can enhance the antigen－specific mucosal and Th1－typ systemic immune response．

CpG oligodeoxynucleotide;recombinant Lactococcus lactis;Intranasal immunization

ZENG Xian-yin

P392

A

:0529-6005(2017)01-0034-03

2015-08-31

王振華(1975-)，女，博士，副教授，主要從事動物微生態學及動物疫病防控的研究，E-mail:363150834@qq．com

曾憲垠，E-mail:616920885@qq．com