杏鮑菇與白靈菇紅斑病病原菌拮抗菌的篩選與鑒定*

榮成博，胡 杰，楊永利，趙 爽，王守現，馬 康，黃晨陽，劉 宇

（1.北京市農林科學院植物保護環境保護研究所，北京市食用菌工程技術研究中心，北京100097；

2.農業部都市農業（北方）重點實驗室，北京100097；3.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京100081）

杏鮑菇與白靈菇紅斑病病原菌拮抗菌的篩選與鑒定*

榮成博1，2，胡 杰1，2，楊永利1，2，趙 爽1，2，王守現1，2，馬 康1，2，黃晨陽3**，劉 宇1，2

（1.北京市農林科學院植物保護環境保護研究所，北京市食用菌工程技術研究中心，北京100097；

2.農業部都市農業（北方）重點實驗室，北京100097；3.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京100081）

篩選并鑒定杏鮑菇和白靈菇紅斑病病原菌的拮抗菌，為該病的生物防治提供實驗證據。通過牛津杯法篩選拮抗菌，并通過16s rDNA分析進行拮抗菌鑒定。結果表明，篩選到杏鮑菇紅斑病病原菌的拮抗菌1株，為GL110，白靈菇紅斑病病原菌的拮抗菌2株，分別為GL110和GL52。GL110鑒定為類芽孢桿菌屬細菌，GL52鑒定為貪銅屬細菌。

杏鮑菇；白靈菇；紅斑病；拮抗菌

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）和白靈菇（Pleurotus nebrodensis）美味可口，營養豐富，并具有一定的藥用價值，是我國的珍稀食用菌品種。隨著杏鮑菇和白靈菇工廠化、周年化生產的迅猛發展，其病害逐年增多并加重，嚴重制約食用菌產業的持續、健康、穩定發展，近年來紅斑病成為杏鮑菇和白靈菇栽培的新興病害，目前并無防治手段。Xu等[1]2014年首次報道了北京房山工廠化車間的杏鮑菇紅斑病，鑒定其病原菌為對稱擲孢酵母（Sporobolomyces symmetricus）。Wang等[2]2015年首次報道了北京地區白靈菇紅斑病，其病原菌為粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）。

近年來，生物防治在多種植物病害防治的過程中發揮了重要作用，該方法具有環境友好、無污染的優點。如土壤或者植物根際引入生防微生物能防治馬鈴薯黑痣病等多種土傳病害[3]，利用拮抗菌來控制小麥赤霉病具有很好的防治效果。目前，在食用菌病害防治方面上并無任何生物防治的研究。本研究篩選并鑒定了杏鮑菇和白靈菇紅斑病病原菌的拮抗菌，以其為紅斑病的生物防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供試病原菌和供試拮抗菌由北京市農林科學院植物保護環境保護研究所保存。

1.1.2 試劑

pMD19-T Vector購于Takara公司，PCR試劑（2×Taq PCR MasterMix） 購于北京艾德萊生物科技有限公司，蛋白胨、酵母粉購于Oxoid公司。氯化鈉、磷酸二氫鉀等其他試劑為分析純，購于北京化工廠。

1.1.3 儀器與設備

HYG-A全溫搖瓶柜，太倉市實驗設備廠；YXQ-LS-30SLL立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；生物安全柜，Thermo公司。1.1.4 培養基

LB液體培養基：蛋白胨10 g·L-1、酵母粉5 g·L-1、氯化鈉10 g·L-1，pH7.2～7.4。

綜合PDB液體培養基：將去皮片狀的馬鈴薯200 g在1 L水中煮沸30 min，16層紗布過濾，收集濾液并與葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、維生素B110 mg混勻后加水定容至1 L，錐形瓶分裝后115℃滅菌30 min。

綜合PDA培養基：PDB培養基中加入20 g·L-1瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的篩選

菌液的制備：將病原菌接種于20 mL綜合PDB液體培養基中，28℃、200 r·min-1培養3 d；供試拮抗菌共40個，接于3mL LB液體培養基中，28℃、200 r·min-1搖床培養2 d。

拮抗菌的初篩：將病原菌菌液分別加到融化的綜合PDA培養基（45℃～50℃）中混勻，接菌量為培養基的1%～2%；將混勻的培養基分別倒入平皿中；待培養基完全冷卻后用打孔器在培養基邊緣均勻打10個孔并編號，將培養好的拮抗菌菌液400 μL分別加入打好的孔中。將培養基置于25℃恒溫培養箱中培養3 d觀察透明圈。

拮抗菌的復篩：采用牛津杯法，將20 mL滅菌的培養基加熱溶解倒入平皿中，待其完全冷卻，在邊緣中等距離均勻放置牛津杯；再加熱溶解20 mL培養基，待其冷卻至45℃～50℃，加入40 μL培養好的菌液混勻后倒入平皿。待培養基完全冷卻，在牛津杯中分別加入待篩的拮抗菌，25℃恒溫培養3 d～4 d觀察。

1.2.2 拮抗菌的鑒定

取1 μL菌液做為模版，以16s8F（5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’）和16s1492R（5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’） 為引物進行PCR擴增。PCR產物進行切膠回收，連接到pMD19-TVector后轉入大腸桿菌DH10B感受態細胞，經藍白篩選后挑陽性克隆送北京中美泰和公司測序。將菌株16s基因序列與GenBank數據庫中已知相關序列進行比對 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi），采用MEGA5構建系統發育樹。采用Kimura2-parameter算法計算遺傳距離，用Neighbor-Joining法構建系統發育樹，重復抽樣1 000次分析系統數各分枝的信任度。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌的篩選

GL52、GL110菌株對粘紅酵母、對稱擲孢酵母的抑制作用見圖1。

圖1 GL52、GL110菌株對粘紅酵母、對稱擲孢酵母的抑制作用Fig.1 The antagonism of strain GL52、GL110 against Rhodotorula glutinis and Sporobolomyces symmetricus

經過初篩和復篩的兩輪篩選，產生透明圈的為能夠抑制病原菌生長的拮抗菌，對白靈菇病原菌（粘紅酵母） 有明顯抑制作用的菌株為 GL52、GL110；能夠明顯抑制杏鮑菇病原菌-對稱擲孢酵母的菌株為GL110。拮抗菌復篩結果見表1。

由表1可知GL52和GL110對粘紅酵母的抑菌圈直徑分別為32.30 mm和31.17 mm；GL110對對稱擲孢酵母的抑菌圈直徑為17.36 mm。

表1 拮抗菌復篩結果Tab.1 The results of antagonistic screening

2.2 拮抗菌株的鑒定結果

2.2.1 拮抗菌株GL110的鑒定

以16S rDNA序列為基礎的GL110菌株系統發育樹見圖2。

PCR擴增GL110菌株的16S rDNA序列，連接到pMD19-T vector上并測序，將測序結果在NCBI網站上用BLAST程序進行比對，選取相似性較高的菌株，用MEGA5.0軟件構建系統發育樹。結果表明，該菌株與Paenibacillus屬菌株的遺傳關系最近。

圖2 以16S rDNA序列為基礎的GL110菌株系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the strain GL110 based on 16S rDNA sequence

2.2.2 拮抗菌株GL52的鑒定

以16S rDNA序列為基礎的GL52菌株系統發育樹見圖3。

參照1.2.2方法進行GL52菌株鑒定，圖3結果表明GL52菌株與Cupriavidus屬菌株遺傳關系最近。

3 討論和結論

紅斑病是杏鮑菇和白靈菇栽培中的新興病害，若不及時處理會形成更嚴重的污染和擴散，影響食用菌的產量，給企業造成巨大的損失。2014年Xu等[1]首次對該病進行了報道，目前并無該病的任何防治手段。拮抗菌為主的生物防治在植物病害防治方面研究較多，如解淀粉芽孢桿菌對小麥赤霉病的防治效果高達79%～88%[5]，放線菌FX-03對番茄早疫病的防治效果達到了75%以上[6]。

本研究首次對杏鮑菇和白靈菇的病原菌進行了拮抗菌篩選，共篩選到了2株抑制白靈菇病原菌生長的拮抗菌GL110和GL52，1株抑制杏鮑菇病原菌生長的拮抗菌GL110。對GL110和GL52分別進行了16SrDNA測序和系統發育樹的構建，結果表明GL110與類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）同源關系最近，GL52與貪銅屬（Cupriavidus）具有較高同源性。已有報道多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）和貪銅屬（Cupriavidus） 具有抑制植物病原菌的活性[7-8]。

圖3 以16S rDNA序列為基礎的GL52菌株系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the strain GL52 based on 16S rDNA sequence

[1]Xu F,Wang S,Liu Y,et al.First report of Sporobolomyces symmetricus induced red spot disease of Pleurotus eryngii in China[J].Plant Disease,2014,98 (5):693.

[2]Wang S,Rong C,Ma Y,et al.First report of Rhodotorula glutinis-induced red spot disease of Pleurotus nebrodensis in China[J].Journal of Plant Pathology,2015,97(1):218.

[3]關小敏，孟品品，劉星，等.馬鈴薯黑痣病生防菌的篩選和鑒定及其生長條件的研究[J].干旱地區農業研究，2015，33（3）：90-95.

[4]徐劍宏，王建偉，胡曉丹，等.小麥赤霉病菌拮抗菌的分離鑒定及其拮抗特性[J].江蘇農業學報，2013，29（3）：517-522.

[5]藺國強，廖玉才，宮安東，等.禾谷鐮刀菌拮抗菌的篩選與鑒定[J].華中農業大學學報，2013，32（3）：28-32.

[6]趙芳華，楊麗麗，沈志紅.拮抗菌對番茄早疫病的防治效果[J].山西農業科學，2014，42（1）：60-65.

[7]鄒芳蕓，陳曉明，候軍黃，等.煙草主要病原菌拮抗菌的篩選[J].食品工業科技，2015，36（9）：175-178.

[8]K?berl M,Ramadan EM,Adam M,et al.Bacillus and Streptomyces were selected as broad-spectrum antagonists against soilborne pathogens from aridareas in Egypt[J].FEMS Microbiol Lett,2013,342 (2):168-178.

Isolation and Identification of Antagonistic Strains Against Red spot Disease of Pleurotus eryngii and Pleurotus nebrodensis

RONG Cheng-bo1,2,HU Jie1,2,YANG Yong-li1,2,ZHAO Shuang1,2,WANG Shou-xian1,2, MA Kang1,2,HUANG Chen-yang3,LIU Yu1,2
(1.Institute of Plant and Environment Protection,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science,Beijing Engineering Research Center for Edible Mushroom,Beijing 100097,China;2.Key Laboratory of Urban Agriculture(North),Ministry of Agriculture,Beijing 100097,China;3.Institute of Agricultural Resources and Regional Planning,CAAS,Beijing 100097,China)

Isolation and identification of antagonistic strains against red spot disease of Pleurotus eryngii and Pleurotus nebrodensis could provided the experimental evidence for biological control of the disease.The antagonistic strains against red spot disease of P.eryngii and P.nebrodensis were isolated and identified by oxford cup tests and the analysis on 16s rDNA.The results showed that a strain GL110 with inhibitory activity against P.eryngii pathogen,and the strains GL110 and GL52 displayed antagonistic activities against P.nebrodensis pathogen.GL110 and GL52 were identified as Cupriavidus respectively.

Pleurotus eryngii;Pleurotus nebrodensis;red spot disease;antagonistic strains

S646.9

A

1003-8310（2017）02-0056-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.02.015

國家科技支撐計劃課題食用菌生產質量安全控制關鍵技術研究 （2013BAD16B03）；北京市優秀人才培養資助計劃（2015000020060G138）；北京市農林科學院青年基金項目 (QNJJ201524)。

榮成博（1981-），女，博士，助理研究員，主要從事食用菌病害和遺傳研究。E-mail:woshiboer@163.com

**通信作者：黃晨陽（1977-），男，博士，副研究員，主要從事食用菌遺傳育種和菌種質量檢測工作。E-mail:huangchenyang@caas.cn

2017-01-12