傳統酸肉中可降低膽固醇乳酸菌的分離篩選及鑒定

劉曉強

摘要 通過不同培養基篩選傳統酸肉中能夠降低膽固醇的乳酸菌，并對其進行鑒定。結果表明：有36株降膽固醇乳酸菌從傳統發酵酸肉中分離出來，其中菌株CT24的降膽固醇能力最強，膽固醇降低率達31.23%，對應降膽固醇的量為62.89 ？滋g/mL。經對菌株CT24進行形態學觀察、生化指標鑒定，初步確認該菌為消化乳桿菌。

關鍵詞 傳統酸肉；降膽固醇乳酸菌；分離；篩選；鑒定

中圖分類號 TS251 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）03-0238-01

Abstract The Lactobacillus which could reduce cholesterol was screened by different culture media from traditional acid meat.The results showed that there were 36 strains Lactobacillus which separated from traditional acid meat，and cholesterol reducing ability of the strain CT24 was the strongest，the cholesterol reduction rate was up to 31.23%，and the amount of cholesterol reduction was about 62.89 ？滋g/mL.After the morphological observation and biochemical identification of the strain CT24，it was confirmed that the bacteria were Lactobacillus.

Key words traditional acid meat；cholesterol reducing Lactobacillus；isolation；screening；identification

生活在我國貴州省荔波縣一帶的布依族，有一種獨特的食肉方法，即用生鮮豬肉腌制酸肉，每片肉上略帶幾粒米或花椒顆，味清香，食之皮脆，肉鮮，酸味適中，香氣四溢，清爽上口，無油膩感。有相關研究表明，這種經過傳統發酵后的豬肉中滋生著大量的微生物。本研究旨在純化這些微生物，以尋找具有能夠降低膽固醇的乳酸菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試材與試劑。傳統酸肉，購自貴州省荔波縣農貿市場。供試試劑：生理鑒定用麥芽糖、甘露醇、甘露糖、鼠李糖等糖（醇）類藥品均為分析純，購自天津制藥有限公司；牛血清白蛋白、蛋白胨等（生化試劑），上海博星生物技術有限責任公司提供；肌醇等（生化試劑）、考馬斯亮藍G-250等（均為分析純），膽固醇、磷酸氫二鉀，天津市富龍化工試廠提供。

1.1.2 供試儀器與設備。超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、高壓滅菌鍋（上海中安醫療器械廠）、電熱恒溫培養箱（上海恒科技有限公司）、722分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）、pH計（梅特勒一托利多儀器有限公司）、光學顯微鏡（重慶光學儀器廠）。

1.1.3 試驗用培養基。分離培養基：MRS培養基、改良MC培養基；鑒定培養基：葡萄糖產氣試驗用培養基、膽固醇膠束高膽固醇培養基（高膽固醇培養基Ⅱ）、PY培養基、雞蛋高膽固醇培養基（高膽固醇培養基Ⅰ）、明膠基礎培養基、硝酸鹽還原試驗培養基、MRS液體培養基、碳水化合物發酵產酸試驗用培養基、碳酸鈣-MRS固體培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 膽固醇含量的測定。參照《食品中膽固醇的測定》（GB/T 5009.128—2003）進行膽固醇含量的測定。以吸光度（A560 nm）為縱坐標，膽固醇標準溶液質量濃度為橫坐標，得到y=0.005 9x-0.007 8（R2=0.991 6）的標準曲線。

1.2.2 乳酸菌的分離鑒定。乳酸菌的分離參考《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》（GB 4789.35—2010）方法實施。參照《乳酸細菌分離鑒定及實驗方法》以及《伯杰細菌鑒定手冊》第八版對篩選到的菌株進行鑒定。

1.2.3 篩選菌株降膽固醇作用初步研究。

（1）粗酶液提取[1-2]。收集CT24菌株培養的上清液和菌體沉淀液，分別對其進行濃縮和離心，然后向其中添加體積分數為0.4%、0.6%、0.9%、1.2%、1.6%、2.0%的TritonX-100，4 ℃條件下靜置4～5 h，分別檢測上述上清液的酶活力和蛋白質的含量；分別取等量的8份上清液分別添加能使溶液飽和度達到30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的硫酸銨進行靜止沉淀，4 ℃條件下靜置過夜后棄去上清液，檢測沉淀的酶活力和蛋白質含量。

（2）酶活力測定。將膽固醇溶液、酶溶液、ATP鹽溶液放入具塞試管中，振蕩混勻后在37 ℃水浴中反應15 min左右，測定560 nm吸光度值，再根據標準曲線方程得到膽固醇含量，以被酶降解的膽固醇量反映酶活力。酶活力計算公式如下：

酶活力（U/mL）=

式中：K為酶溶液稀釋倍數；m為轉化膽固醇（？滋g）；V為液體容積（mL）；T為反應時間（h）。

（3）蛋白質含量測定。蛋白質含量采用考馬斯亮藍G-250法來測定。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離及降膽固醇乳酸菌的初篩

在碳酸鈣培養基上挑選出具有典型乳酸菌菌落形態的菌株，在37 ℃條件下靜置培養24～48 h，劃線純化3代后進行革蘭氏染色鏡檢。

將36株經純化的乳酸菌菌株分別標識為CT1—CT36，加入高膽固醇培養基Ⅰ進行培養，測定膽固醇降低情況，未添加菌種的培養液中膽固醇量為201.37 ？滋g/mL，菌株CT24膽固醇降低率達31.23%，對應降膽固醇的量為62.89 ？滋g/mL，其他菌株降低膽固醇的量極低，均低于12%。

2.2 篩選菌株的形態學鑒定

將篩選出的CT24菌株在MRS培養基平板上劃線純化，并對其進行顯微鏡觀察，結果顯示其個體形態為細胞桿，G+，菌落乳白色，邊緣濕潤光滑，不透明。

2.3 篩選菌株的生理生化性質

對篩選菌株CT24生理生化進行鑒定，結果見表1。

2.4 篩選結果

參照《乳酸細菌分離鑒定及實驗方法》以及《伯杰細菌鑒定手冊》[3]第八版，初步鑒定CT24為消化乳桿菌。

3 結論

該研究篩選出一株有較強降低膽固醇能力的乳酸細菌——消化乳桿菌。該菌株來自于食用安全較高的傳統酸肉，同時該菌株能夠符合作為發酵肉制品發酵劑的主要特征[4-10]，具有潛在的工業化推廣的價值。但是該菌株能夠降低膽固醇的原理尚不明確，需要進一步研究[11-14]。

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