GC法同時測定蟬花中三種脂肪酸含量

凡軍民　賈君　陳燕

摘要：分析江蘇茅山地區(qū)蟬花（Isaria cicadae Miquel）中脂肪酸的組成，建立了同時測定蟬花中十六酸甲酯、油酸甲酯和亞油酸甲酯3種脂肪酸含量的方法。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析蟬花中脂肪酸的組成，并用氣相色譜法對其主要脂肪酸進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，蟬花中主要有8種脂肪酸，十六酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯分別在50～500 μg/mL（r=0.999 9）、100～1 000 μg/mL（r=0.999 5）、20～200 μg/mL（r=0.999 3）線性關(guān)系良好，平均回收率分別為97.66%、98.13%、97.33%，RSD分別為1.02%、0.73%、1.03%（n=9）。

關(guān)鍵詞：蟬花（Isaria cicadae Miquel）；氣質(zhì)聯(lián)用；氣相色譜；脂肪酸；含量測定

中圖分類號：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）04-0727-04

蟬花（Cordyceps cicadae）又稱金蟬花、蟬花蟲草、蟬蛹草，是蟲草科（Claviceplaceae）棒束孢屬（Isasia）的寄生蟬類若蟲形成的蟲生真菌，為中國傳統(tǒng)的中藥材[1，2]。其具有清熱、解毒、驅(qū)風(fēng)、鎮(zhèn)痛和明目等多種功效。與名貴中藥材冬蟲夏草的無性同屬，且具有相似的化學(xué)成分及藥用價值[3，4]。現(xiàn)代臨床研究表明，蟬花具有調(diào)節(jié)免疫功能[5-7]、抗腫瘤[7-10]、改善腎功能[11，12]、促進(jìn)造血[13]等藥理作用。

蟬花化學(xué)成分復(fù)雜多樣，主要集中在核苷類物質(zhì)、多糖、多球殼菌素、麥角甾醇等生物活性成分的研究[11，14]，關(guān)于脂肪酸成分及含量的研究報道較少。本研究采用GC-MS法分析江蘇茅山地區(qū)蟬花中脂肪酸的成分，并用GC法測定其中3種主要脂肪酸十六酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯的含量，為蟬花中脂肪酸的鑒別和含量測定提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 AL 204型電子分析天平，梅特勒·托利多公司；MD 200型氮氣吹掃儀，杭州奧盛儀器有限公司；Agilent 7890A GC-5975C MSD型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司。

1.1.2 試藥 正己烷（色譜純）、正十八烷（產(chǎn)品編號40037161，沃凱GCS）由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供，十六烷酸甲酯（標(biāo)物編號SH-N-16-M-100 mg）、亞油酸甲酯（標(biāo)物編號111625）、油酸甲酯（標(biāo)物編號190034）均由北京萬佳首化生物科技有限公司提供。蟬花產(chǎn)自江蘇省句容市磨盤山。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1）內(nèi)標(biāo)溶液的配制。精密稱取0.146 5 g正十八烷，置于50 mL容量瓶中，用環(huán)己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，質(zhì)量濃度為2.93 mg/mL。

2）對照品溶液的配制。a.精密稱取十六烷酸甲酯對照品250 mg，置于50 mL容量瓶中，用正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，質(zhì)量濃度為5 mg/mL。b.精密稱取油酸甲酯對照品100 mg，置于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，質(zhì)量濃度為10 mg/mL。c.精密稱取亞油酸甲酯對照品100 mg，置于50 mL容量瓶中，用正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，質(zhì)量濃度為2 mg/mL。d.混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：十六酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯各取1.0 mL，定容于10 mL容量瓶，質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、0.2 mg/mL。

1.2.2 樣品制備

1）蟬花預(yù)處理。將蟬花去泥洗凈，50 ℃烘至恒重，粉碎，過60目篩，備用。

2）蟬花脂肪酸的超聲提取。精密稱取0.5 g蟬花粉末，置于具塞試管中，加正己烷10 mL，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，過濾，重復(fù)2次。將2次的抽提液合并，用N2氣將濾液吹干（50 ℃），重復(fù)6次。取3次重復(fù)，用2 mL正己烷復(fù)溶，混勻，過0.22 μm濾膜，作為供試溶液，備用。

3）脂肪酸的甲酯化處理。在吹干的蟬花脂肪酸中加入0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液1 mL，搖勻，40 ℃水浴加熱10～15 min，取出冷卻，加入內(nèi)標(biāo)溶液 0.2 mL、正己烷1.8 mL，靜置10 min，取上清液，過 0.22 μm濾膜，作為供試溶液，備用。

1.2.3 分析方法

1）氣相色譜條件。HP-5MS型毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），程序升溫：初始溫度190 ℃，保持17 min，30 ℃/min升溫至220 ℃，保持1 min，5 ℃/min升溫至280 ℃；進(jìn)樣口溫度280 ℃，F(xiàn)ID 檢測器溫度290 ℃；載氣高純氮氣，流速1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL，分流比20∶1。

2）質(zhì)譜條件。EI電離源，電離電壓70 eV；離子源溫度250 ℃；接口溫度290 ℃；離子源掃描質(zhì)量范圍（m/z）50～550；溶劑延遲5 min；通過NIST11標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索，并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜核對進(jìn)行定性分析，按面積歸一化法進(jìn)行定量，測得其相對百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟬花中脂肪酸成分的GC-MS分析

采用GC-MS法分析蟬花脂肪酸，其成分的總離子流色譜見圖1。對各峰進(jìn)行分析，共鑒定出8種脂肪酸類成分。由表1可以看出，蟬花脂肪酸有3種主要成分，分別為十六酸甲酯、亞油酸甲酯、油酸甲酯。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性

在“1.2.3”色譜條件下分析，按“1.2.2”方法制備供試溶液，3種脂肪酸甲酯色譜峰之間的分離度均大于1.5，表明相鄰色譜峰達(dá)到完全分離，色譜圖見圖2。

2.3 線性關(guān)系考察

分別取混合對照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，加內(nèi)標(biāo)溶液0.1 mL，用正己烷定容至2 mL，搖勻，即得5個濃度混合對照品溶液。將混合對照品溶液按“1.2.3”色譜條件測定，重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄各成分峰面積值。以峰面積比（A對照品/A內(nèi)標(biāo)）為縱坐標(biāo)，濃度比（C對照品/C內(nèi)標(biāo)）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算回歸方程。十六酸甲酯、亞油酸甲酯、油酸甲酯的回歸方程分別為Y=0.070 7X+0.002 4（r=0.999 9），Y=0.380 0X+0.006 3（r=0.999 5），Y=0.017 6X+0.005 6（r=0.999 3），在50～500 μg/mL、100～1 000 μg/mL、20～200 μg/mL范圍內(nèi)3個脂肪酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系好。

2.4 精密度試驗

取混合對照品溶液1.2 mL，加內(nèi)標(biāo)溶液0.1 mL，用正己烷定容至2 mL，搖勻，重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積比（A對照品/A內(nèi)標(biāo)）計算精密度，測得A十六酸甲酯/A正十八烷的RSD為1.47%；A油酸甲酯/A正十八烷的RSD為1.48%； A亞油酸甲酯/A正十八烷的RSD為1.47%，符合試驗要求。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取甲酯化處理后的脂肪酸供試溶液，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積值。十六酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、峰面積的RSD（n=6）分別為3.3%、3.1%、3.0%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗

取蟬花粉末6份，按“1.2.2”方法制備供試溶液，氣相色譜儀測定，測得十六酸甲酯平均含量為0.26%，RSD為2.51%；測得油酸平均含量為1.86%，RSD為2.68%；亞油酸平均含量為0.54%，RSD為2.56%，表明樣品制備的重復(fù)性好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取蟬花粉末0.5 g，共9份，加入適量不同濃度脂肪酸甲酯對照品溶液，按“1.2.2”方法制備供試溶液，氣相色譜儀測定。十六酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯平均回收率和RSD見表2。

2.8 含量測定

精密稱取蟬花粉末6份，按“1.2.2”方法制備供試溶液，氣相色譜儀測定。以保留時間定性，根據(jù)外標(biāo)法以峰面積定量，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算脂肪酸的含量。蟬花中十六酸、油酸、亞油酸的含量（w）分別為（0.26±0.09）%、（1.86±0.14）%、（0.54±0.11）%。

3 討論

3.1 主要脂肪酸的確證

通過GC-MS法確證了江蘇茅山地區(qū)蟬花中8種脂肪酸成分，采用GC法同時測定其中3種主要脂肪酸成分十六酸甲酯、油酸甲酯和亞油酸甲酯的含量。蟬花中油酸甲酯和亞油酸甲酯2種不飽和脂肪酸含量較高，相對百分含量分別為9.27%、62.39%，益于心、腦、腎、血管的健康。研究表明，油酸對腫瘤、肉癌、乳癌、肺癌及B細(xì)胞白血病等癌癥顯示出強的活性，在腫瘤的預(yù)防和治療中發(fā)揮了積極的作用。亞油酸是人體不能合成或是合成的量遠(yuǎn)不能滿足需要的必需脂肪酸，具有降低血脂、血壓，軟化血管，促進(jìn)微循環(huán)作用，能預(yù)防動脈粥樣硬化及心腦血管疾病。因此，蟬花中不飽和脂肪酸油酸和亞油酸的含量與相關(guān)藥理學(xué)的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

3.2 色譜條件的選擇

采用150～180 ℃柱溫作為初始溫度，除溶劑峰外，色譜圖基本沒有峰；以190 ℃作為初始溫度進(jìn)行程序升溫，結(jié)果色譜峰的分離效果較好且基線平穩(wěn)。樣品采用分流進(jìn)樣20∶1，測定用樣品含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)，色譜峰并能完全分離。

3.3 提取方法的選擇

采用超聲提取、索氏提取2種方法進(jìn)行提取，蟬花中脂肪酸相對含量分別為17.32%、14.42%，索氏提取法提取脂肪酸比超聲提取法高3%；用索氏提取法提取測得蟬花中十六酸、油酸、亞油酸的含量（w）分別為（0.27±0.05）%、（2.35±0.16）%、（0.61±0.08）%，2種方法提取的十六酸、亞油酸含量無差異，索氏提取法提取測得蟬花中油酸含量高于超聲提取法。索氏提取法方法較繁瑣、加熱回流時間較長，因此選擇超聲提取。

4 小結(jié)

本研究采用超聲提取法提取蟬花中脂肪酸，用GC-MS法對其成分進(jìn)行定性分析，并對其中十六酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯3種主要脂肪酸的含量測定。經(jīng)方法學(xué)考察，該檢測方法重復(fù)性好，氣相色譜圖基線平穩(wěn)，可用于蟬花中脂肪酸含量的測定。

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