聚乙烯醇和海藻酸鈉聯合固定化漢遜德巴利酵母產3—羥基丙酸的研究

董玉瑋　刁咸斌　王陶　張傳麗　高明俠

摘要：采用微膠囊固定化技術，利用聚乙烯醇、海藻酸鈉和氯化鈣制備漢遜德巴利酵母微膠囊，探討了聚乙烯醇、海藻酸鈉、氯化鈣的濃度對漢遜德巴利酵母微膠囊的制備工藝及其產3-羥基丙酸量的影響。結果表明，隨著聚乙烯醇、海藻酸鈉和氯化鈣濃度的分別增加，3-羥基丙酸含量先增加后減少。聚乙烯醇最佳濃度為10.0%，此時3-羥基丙酸含量為（20.01±0.66） g/L；海藻酸鈉為最佳濃度為1.0%，此時3-羥基丙酸含量為（18.71±0.54） g/L；氯化鈣最佳濃度為2.1%，此時3-羥基丙酸含量為（18.37±0.45） g/L。聚乙烯醇和海藻酸鈉聯合固定漢遜德巴利酵母制備微膠囊最佳工藝為10.0%聚乙烯醇，1.0%海藻酸鈉和2.1%氯化鈣，在此條件下3-羥基丙酸含量為（21.53±1.12） g/L。

關鍵詞：固定化；漢遜德巴利酵母；3-羥基丙酸

中圖分類號：TQ926 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）04-0722-05

3-羥基丙酸（3-hp）是一種三碳無手性化合物，是大部分光學物質的前體[1]，能夠發生氧化還原反應得到1，3-丙二醇、丙二酸、丙烯酸等化合物[2]，這些化合物對于制備粘膠劑、纖維、塑料、樹脂、個人護理用品、水處理藥劑等必不可少；3-hp也可以聚合生成聚3-hp，具有強度高、易拉伸、生物降解性好等優點，在環境保護、化學防護等方面具有廣泛的應用前景，被譽為21世紀新興平臺化合物[3]。然而3-hp每年產量都不足，存在巨大的市場缺口，加之其重大的應用價值和潛在的開發價值，吸引國內外研究機構爭先展開深入的研究。

微生物生產3-hp可以避免化學合成法帶來的諸多不良因素，具有生產時間短、材料容易得到、對環境無害、成本低等優勢。1982年長谷川等發現皺褶假絲酵母可用于發酵生產3-hp。但是微生物自身存在不穩定、對環境敏感、易死亡、不可再生等缺點。如果引入固定化細胞技術則可以克服這些缺點。固定化細胞技術是指將細胞用物理或化學方法限制或定位在某一特定空間，保留其原有的活性，能被重復和連續使用的技術手段[4]，具有高穩定性、簡便、連續化使用、易控制等優點，可提高產物的純度和過程效率[5，6]。其中包埋法是最常用的微生物固定化方法[7]，而聚乙烯醇、海藻酸鈉等有機高分子則可以作為良好的包埋載體材料[8]。

本研究采用經實驗室保存并培養的漢遜德巴利酵母，利用聚乙烯醇和海藻酸鈉聯合進行固定化培養，確定聚乙烯醇、海藻酸鈉、氯化鈣濃度等研究固定化條件，為后續的研究提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

1）菌種。漢遜德巴利酵母，實驗室保存。

2）試劑。海藻酸鈉、乙醇、硫酸、苯酚等均為分析純。

3）培養基。種子培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，瓊脂粉20 g/L，丙酸10 mL。發酵培養基：葡糖糖30 g/L，酵母膏10 g/L，（NH4）2SO4 10 g/L，KH2PO4 5 g/L，K2HPO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，丙酸10 mL，調節pH至6.0。

4）主要儀器設備。FA21040電子天平，北京精密儀器公司；IXQ-SG46-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊有限公司；HZ150L恒溫培養搖床，武漢瑞華儀器設備有限責任公司；250D恒溫光照培養箱，常州國華電器有限公司；DL-5低速大容量離心機，上海安亭儀器廠；高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 漢遜德巴利酵母的培養 漢遜德巴利酵母的固體培養；采用本實驗室斜面保存的漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii），經中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心鑒定，保藏號為CGMCC No.11893。種子培養基，31 ℃恒溫培養3 d。漢遜德巴利酵母的液體培養：采用長勢較好的漢遜德巴利酵母菌進行液體培養，31 ℃、150 r/min搖床培養3 d，發酵液沉淀過濾后用于3-羥基丙酸測定。

1.2.2 固定化小球的制備 將漢遜德巴利酵母液體發酵液靜置0.5 h，過濾后菌體沉淀加入到一定濃度海藻酸鈉與聚乙烯醇混合膠體中混勻，菌膠比2∶1。用5號針筒吸取混合液滴入一定濃度的CaCl2溶液中制成固定化小球，粒徑約0.3～0.5 cm，常溫下固定2 h，4 ℃冰箱固定2 h。小球用無菌水沖洗2～3遍后放入液體培養基，31 ℃、150 r/min搖床培養3 d。

1）聚乙烯醇濃度的確定。分別以8.0%、9.0%、10.0%、11.0%、12.0%的聚乙烯醇在1.0%海藻酸鈉和2.1%氯化鈣的條件下，固定漢遜德巴利酵母，按固定化小球2個/mL培養基接種，100 mL培養基/250 mL三角瓶，31 ℃、150 r/min培養3 d，測定3-羥基丙酸含量。

2）海藻酸鈉濃度的確定。分別以0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%的海藻酸鈉在10.0%的聚乙烯醇和2.1%的氯化鈣的條件下，固定漢遜德巴利酵母，按固定化小球2個/mL培養基接種，100 mL培養基/250 mL三角瓶，31 ℃、150 r/min培養3 d，測定3-羥基丙酸含量。

3）氯化鈣濃度的確定。分別以1.7%、1.9%、2.1%、2.3%、2.5%的氯化鈣在1.0%的海藻酸鈉和10.0%的聚乙烯醇的條件下，固定漢遜德巴利酵母，按固定化小球2個/mL培養基接種，100 mL培養基/250 mL三角瓶，31 ℃、150 r/min培養3 d，測定3-羥基丙酸含量。

1.2.3 3-羥基丙酸的測定 3-羥基丙酸的方法：采用高效液相色譜法，3-羥基丙酸在210 nm有吸收峰，紫外檢測器210 nm；色譜柱規格：迪馬C18 250×4.6 mm，5 μm；pH范圍為1.5～9.0；流動相：3%甲醇-97%水；柱溫：35 ℃；流速為0.8 mL/min；進樣量為20 μL，檢測3-羥基丙酸含量

1）3-羥基丙酸標準曲線繪制。配置濃度梯度為2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 g/L的3-羥基丙酸標準工作液，靜置過夜后檢測。

2）樣品中3-羥基丙酸的測定。取固定化漢遜德巴利酵母的培養液經4 000 r/min離心5 min，用0.22 μm濾膜過濾后檢測3-羥基丙酸的含量。

1.2.4 數據分析 采用Origin 8.1軟件對數據進行作圖和統計分析，所有數據用平均數±標準差（x±s）表示。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜條件的確定

由于底物丙酸、發酵產物3-羥基丙酸以及可能產生的同分異構體乳酸都為有機弱酸，易電離，pH大都在2～3。試驗表明，隨著流動相pH逐漸增高樣品的分離度越低，然而低pH對色譜柱有較大損傷，結合色譜柱自身pH范圍，確定流動相pH為2.0。甲醇所占比例越高分離度越低，由此選擇pH 2.0含有3%甲醇的流動相。

2.2 3-羥基丙酸標準曲線

根據峰面積與濃度之間的關系求得直線方程。由圖1可知，3-羥基丙酸的出峰時間為5.6 min左右。圖2為根據峰面積繪制的標準曲線，得一元線性方程y=75.324x-18.625，經顯著性檢驗，R2=0.999 0，說明3-羥基丙酸含量與峰面積之間具有極顯著的線性關系。

2.3 固定化小球的制備

2.3.1 高效液相色譜條件的確定 通過試驗可知，隨著流動相的pH逐漸增高樣品的分離度越低，流動相中甲醇所占比列越高分離度越低，由此選擇pH 2.0含有3%甲醇的流動相。

2.3.2 聚乙烯醇濃度對固定化小球形態的影響 分別采用8.0%、9.0%、10.0%、11.0%、12.0%聚乙烯醇和1.0%海藻酸鈉制備固定化小球。從圖3、表1中可以看出，當聚乙烯醇濃度低于9.0%時，固定化小球硬度很軟；當聚乙烯醇濃度高于11.0%時，固定化小球硬度很硬；當聚乙烯醇濃度在9.0%～10%時，固定化小球透明度適中，硬度適中，呈球形，尾巴不明顯。因此初步選擇聚乙烯醇濃度為9.0%～11.0%。

2.3.3 海藻酸鈉濃度對固定化小球形態的影響 分別采用0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%海藻酸鈉和10.0%聚乙烯醇制備固定化小球。從圖4、表2中可以看出，當海藻酸鈉濃度低于0.9%時，固定化小球硬度很軟；當海藻酸鈉濃度高于1.1%時，固定化小球硬度很硬；當海藻酸鈉濃度在0.9%～1.1%時，固定化小球透明度適中，硬度適中，呈球形，尾巴不明顯。因此初步選擇海藻酸鈉濃度范圍為0.9%～1.1%。

2.3.4 氯化鈣濃度對固定化小球形態的影響 采用1.0%海藻酸鈉和10.0%聚乙烯醇混合在1.7%、1.9%、2.1%、2.3%、2.5%氯化鈣的條件下制備固定化小球。從圖5、表3中可以看出，當氯化鈣濃度低于1.9%時，固定化小球硬度很軟；當氯化鈣濃度高于2.3%時，固定化小球硬度很硬；當氯化鈣濃度在1.9%～2.3%時，固定化小球透明度適中，硬度適中，呈球形，尾巴不明顯。因此初步選擇氯化鈣濃度范圍為1.9%～2.3%。

2.4 固定化細胞發酵液3-羥基丙酸的測定

由圖1可知，3-羥基丙酸的出峰時間為5.6 min，圖6中5.6 min也有峰出現，3-羥基丙酸含量為4.55 g/L。

2.5 不同聚乙烯醇濃度下3-羥基丙酸含量

根據初步試驗可知，在其他相同條件下，聚乙烯醇濃度為9.0%、10.0%、11.0%時制備固定化小球， 31 ℃培養3 d，測定3-羥基丙酸的含量（圖7）。從圖7可以看出，3-羥基丙酸隨著聚乙烯醇濃度的增加，先增加后減少，10.0%的聚乙烯醇為最佳濃度，此時3-羥基丙酸的含量為（20.01±0.66） g/L。

2.6 不同海藻酸鈉濃度下3-羥基丙酸含量

根據初步試驗可知，在其他相同條件下，海藻酸鈉濃度為0.9%、1.0%、1.1%時制備固定化小球，31 ℃培養3 d，測定3-羥基丙酸的含量。從圖8可以看出，3-羥基丙酸的含量隨著海藻酸鈉濃度的增加先增加后減少，1.0%海藻酸鈉為最佳濃度，此時3-羥基丙酸的含量為（18.71±0.54） g/L。

2.7 不同氯化鈣濃度下3-羥基丙酸含量

根據初步試驗可知，在其他相同條件下，氯化鈣濃度為1.9%、2.1%、2.3%時制備固定化小球，31 ℃培養3 d，測定3-羥基丙酸的含量。從圖9可以看出，3-羥基丙酸的含量隨著氯化鈣濃度的增加先增加后減少，2.1%的氯化鈣為最佳濃度，此時3-羥基丙酸的含量為（18.37±0.45） g/L。

2.8 最佳固定化條件

固定化漢遜德巴利酵母的最佳工藝為聚乙烯醇的濃度10.0%；海藻酸鈉的濃度1.0%；氯化鈣濃度2.1%。在此條件下3-羥基丙酸含量為（21.53±1.12） g/L，未固定化漢遜德巴利酵母3-羥基丙酸含量為（18.34±0.89） g/L，固定化后3-羥基丙酸含量提高了17.39%。

3 小結與討論

1）聚乙烯醇和海藻酸鈉聯合固定化漢遜德巴利酵母的特點。聚乙烯醇需要先冷水溶脹，再熱水溶解用于制備，充分的溶脹可以使形成的固定化小球更牢固，同時聚乙烯醇自身進行交聯后，可以減少在水中的溶解；由于產物3-羥基丙酸是有機酸，加入聚乙烯醇能提高載體的成球性，保護載體，且聚乙烯醇較海藻酸鈉強度更高，因此聚乙烯醇含量（10%）遠高于海藻酸鈉含量（1.0%），可以保證固定化小球的穩定性；經過多次重復試驗，證實聯合固定化漢遜德巴利酵母在培養階段未發生破裂與溶解現象，固定化小球形態沒有明顯變化。

2）固定化漢遜德巴利酵母較未固定化細胞的優勢。目前國內外主要通過菌種誘變、基因重組方式獲得高產3-羥基丙酸的菌株，本研究采用固定化工藝固定漢遜德巴利酵母，較未固定化細胞產3-羥基丙酸能力也有一定的提升。與未固定細胞相比，固定化工藝主要的優勢包括：①按菌膠比為2∶1和2個固定化小球/mL培養基接種，菌種密度和固定化小球數量都較高，成功獲得了較高的3-羥基丙酸含量；②固定化工藝采用制備微膠囊小球，由于體積小，比表面積大，用于發酵培養時，增加了培養基與小球的接觸面積，更有利于菌種繁殖和生產3-羥基丙酸；③固定化小球可以重復利用，無需反復接種，尤其是固定化細胞在反復使用過程中，菌種保持較高繁殖能力，生長延遲期很短，節省了生產3-羥基丙酸的時間。

3）從固定化小球形態學判斷，較適聚乙烯醇濃度范圍是9.0%～11.0%，較適海藻酸鈉濃度范圍是0.9%～1.1%，較適氯化鈣濃度范圍是1.9%～2.3%，固定化小球透明度適中，硬度適中，成球形無拖尾。采用高效液相色譜測定3-羥基丙酸含量，確定聚乙烯醇和海藻酸鈉聯合固定漢遜德巴利酵母最佳工藝為10.0%聚乙烯醇，1.0%海藻酸鈉，2.1%氯化鈣。在此條件下3-羥基丙酸含量為（21.53±1.12） g/L，較未固定化漢遜德巴利酵母3-羥基丙酸含量提高了17.39%。

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