氧化苦參堿對臺灣乳白蟻纖維素酶活性的抑制作用*

谷岱霏 嚴善春 李志強

(1. 東北林業大學林學院 哈爾濱 150040； 2. 廣東省生物資源應用研究所 廣東省野生動物保護與利用公共實驗室 廣東省動物保護與資源利用重點實驗室 廣州 510260)

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氧化苦參堿對臺灣乳白蟻纖維素酶活性的抑制作用*

谷岱霏1嚴善春1李志強2

(1. 東北林業大學林學院 哈爾濱 150040； 2. 廣東省生物資源應用研究所 廣東省野生動物保護與利用公共實驗室 廣東省動物保護與資源利用重點實驗室 廣州 510260)

【目的】 研究植物源成分氧化苦參堿對臺灣乳白蟻纖維素酶活性的抑制作用，為探討氧化苦參堿在白蟻預防與控制方面的應用提供依據。【方法】 在室內條件下[溫度(26±1)℃，相對濕度65%±5%,黑暗無光照)，供試臺灣乳白蟻經饑餓處理2 天后，用1%氧化苦參堿溶液處理濾紙后飼喂，分別于飼喂6 h、12 h、1 天、3 天、5 天、7天收集臺灣乳白蟻消化道，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，還原糖法測定比較白蟻消化道的濾紙酶活性(FPA)及內切β-1,4-葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(BG)和纖維二糖水解酶(CBH)的比活力，并于7 天后觀測記錄供試白蟻的質量變化與死亡率。【結果】 在測定分析的時間內，除6 h處理組FPA和CBH活性與對照差異不顯著外，1%氧化苦參堿對臺灣乳白蟻FPA及EG、BG、CBH的活性均有顯著抑制作用。1%氧化苦參堿對臺灣乳白蟻纖維素酶活抑制率整體表現為FPA>FG≥BG>CBH，纖維素酶活性抑制率隨處理時間的延長而增強，但是5 天EG抑制率、3 天 BG抑制率、12 h CBH抑制率有所降低。臺灣乳白蟻經氧化苦參堿處理7 天后，活動水平明顯減弱，工蟻質量處理組顯著低于對照組，白蟻死亡率處理組顯著高于對照組。【結論】 本研究明確了1%氧化苦參堿對臺灣乳白蟻FPA及EG、BG、CBH的活性均具有明顯的抑制作用，表明纖維素酶活性的抑制作用是氧化苦參堿殺蟲活性的機制之一。氧化苦參堿對臺灣乳白蟻具有慢性致死活性，利用氧化苦參堿對臺灣乳白蟻纖維素消化的抑制作用，研發臺灣乳白蟻消化抑制劑應用于白蟻的防治是一種值得探索的方法。

臺灣乳白蟻； 氧化苦參堿； 纖維素酶； 抑制作用

白蟻(Isoptera)是利用纖維素類物質最為成功的昆蟲，全世界白蟻種類有近3 000種(Krishnaetal., 2013)，作為生態系統的高效分解者發揮著重要的生態作用(Bignelletal., 2000)。白蟻每年能夠消耗74%～99%的木材纖維素，強大的纖維素消化能力與其具有豐富的纖維素酶密切相關(Breznaketal.,1994； Watanabeetal., 2010)。白蟻體內通常包括3種類型的纖維素酶，即內切葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanases，EG，EC 3.2.1.4)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BG，EC 3.2.1.21)、外切葡聚糖酶(exo-β-1,4-glucanases，C1，EC 3.2.1.91)。外切葡聚糖酶包括纖維二糖水解酶(cellobilohydrolase，1,4-β-D- glucancellobiohydrolase，CBH)和外葡萄糖水解酶(exoglucohydrolase，1,4-β-D-glucanexoglucohydrolase)(相輝等， 2009； Lietal., 2009)。

在白蟻類群中，約2.8%的物種對木材、建筑材料等構成嚴重危害(Watanabeetal., 2001； Rustetal., 2012)，白蟻安全防治技術一直是白蟻防治研究的重要方向之一(Vermaetal., 2009)。隨著環境與人類健康問題的日益突出以及POPs公約的全面實施，對白蟻預防與防治替代性藥物與新措施的研究再次受到關注(Rustetal., 2012)。臺灣乳白蟻(Coptotermesformosanus)(等翅目 Isoptera: 鼻白蟻科Rhinotermitidae)是已知危害嚴重且易傳播蔓延的世界性有害白蟻種類之一，在我國華南地區為害尤為嚴重(Evansetal., 2013)。目前利用病原微生物控制白蟻并沒有明顯的應用價值，而利用植物源活性成分控制白蟻的研究日益受到重視(Vermaetal., 2009； Chouvencetal., 2011)。植物源活性成分的研究報道多關注于白蟻觸殺、驅避和拒食活性，用于保護木材與建筑結構等(Maistrelloetal., 2003; Rainaetal., 2012)。

氧化苦參堿(oxymatrine)是從豆科植物苦參(Sophoraflavescens)中提取的一種生物堿。苦參在我國分布廣泛，苦參生物堿具有廣譜的殺蟲效果及抑菌活性，可用于防治多種農業害蟲如桃蚜(Myzuspersicae)、褐飛虱(Nilaparvatalugers)等，對白蟻也有一定的防治效果(袁靜等， 2004； Maoetal., 2007)。Mao等(2007)研究發現氧化苦參堿對臺灣乳白蟻的毒性較低，高劑量具有顯著的拒食活性，但對白蟻取食消化過程中纖維素酶活性是否產生影響尚無報道。1%氧化苦參堿對白蟻具有一定的慢性胃毒作用，本文研究氧化苦參堿對臺灣乳白蟻濾紙酶活性(filter paper activity，FPA)及纖維素酶EG、BG、CBH活性的影響，為探討氧化苦參堿在白蟻預防與控制方面的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試白蟻 供試蟲源采自廣州國際生物島，帶回實驗室用10 L塑料箱(內含松木板)飼養。飼養條件： 溫度(26±1)℃，相對濕度65%±5%，黑暗無光照。試驗前挑取活力較好、大小一致的臺灣乳白蟻工蟻供試。

1.1.2 主要試劑 氧化苦參堿(oxymatrine，美倫生物)，0.9%氯化鈉溶液，SAB緩沖液(醋酸-醋酸鈉緩沖液)，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，AR，天津福晨)，D-水楊苷(D-Salicin，AR，上海阿拉丁)，葡萄糖(BR)，對硝基苯-β-D-纖維二糖苷 (p-NPC，Sigma)，對硝基苯酚(p-NP，Sigma)，碳酸鈉(Na2CO3，AR)，3，5 -二硝基水楊酸(DNS，AR，廣州光華)，酒石酸鉀鈉(AR，天津福晨)，結晶酚(AR，北京鼎國)，無水硫酸鈉(AR)，考馬斯亮藍 G-250(廣州化學)，牛清血蛋白組分V(BSA，北京鼎國)。

1.2 方法

1.2.1 臺灣乳白蟻喂食處理 挑取活力較好且大小一致的臺灣乳白蟻工蟻若干，饑餓處理2 天后，分為對照組和處理組，用直徑7 cm的濾紙喂食，2組均重復6次，其中3次重復用于酶活測定，3次重復用于活力與存活情況觀察。處理組濾紙用500 μL 1%氧化苦參堿溶液潤濕，對照組濾紙用500 μL滅菌蒸餾水潤濕，稍晾干后放入直徑9 cm的培養皿中。對用于酶活測定的重復，每培養皿放入白蟻約150頭，置于 26 ℃恒溫培養箱，每天分別添加1次適量滅菌蒸餾水保持濕潤狀態。在處理后6 h、12 h、1 天、3 天、5 天、7天，分別在每個重復中選取活力較好的白蟻各15頭，提取粗酶，用于纖維素酶活性測定。用于生長發育觀察的重復，每培養皿各放入白蟻100頭，測定質量后，進行同上的濾紙喂食試驗，于第7天測定白蟻質量，記錄累計死亡率。

1.2.2 粗酶制備 將選取的15頭白蟻用預冷的0.9%氯化鈉溶液漂洗，用濾紙吸干白蟻表面水分，分別放入裝有500 μL預冷 SAB 緩沖液(0.1 mol·L-1，pH 5.6)的離心管中，用電動組織研磨器(TIANGEN，OSE-Y10)冰浴研磨。4 ℃、12 000 r·min-1離心(Scilogex，D3024R)勻漿液10 min，取上清液；4 ℃、12 000 r·min-1再次離心5 min，取上清液即粗酶液于-20 ℃保存，待酶活測定。

1.2.3 蛋白質濃度的測定 蛋白質濃度采用考馬斯亮藍法(Bradford， 1976)測定。根據制備的粗酶液濃度按一定比例進行稀釋，取50 μL稀釋后的粗酶液加入350 μL考馬斯亮藍G-250顯色劑，混勻后靜置3 min，顯色后采用多功能酶標儀(PerkinElmer，1420- 012 victor3)測定595 nm波長處的吸光值。根據同時測定的牛血清蛋白標準曲線計算粗酶液的蛋白質濃度。每個反應體系重復3次。

1.2.4 濾紙酶活性(FPA)的測定 參照Miller(1959)方法，采用還原糖法測定。每個離心管中放入1張濾紙小圓片(每張濾紙小圓片約3.5 mg，高溫滅菌)，再加入120 μL SAB緩沖液(0.1 mol·L-1，pH 5.6)浸潤濾紙。加入12 μL粗酶液，混勻后于37 ℃恒溫水浴60 min，對照管用SAB緩沖液(0.1 mol·L-1，pH 5.6)代替粗酶液。反應完畢后加入120 μL DNS 溶液，沸水浴5 min顯色后迅速冰浴冷卻，用SAB 緩沖液定容到500 μL，用酶標儀測定540 nm 波長處各樣品的吸光值，同時測定葡萄糖標準曲線的吸光值，根據測定結果計算FPA。每個反應體系重復3次。酶活力單位(U)定義為在37 ℃、pH 5.6反應條件下，每分鐘水解底物產生1 μg還原糖的酶量； 比活力(IU)定義為每毫克酶蛋白的酶活力單位數(U·mg-1)。

1.2.5 內切-β-1,4-葡聚糖酶(EG)和β-葡糖苷酶(BG)活性的測定 EG和BG的活性均采用還原糖法測定，分別以1% CMC-Na溶液和1% Salicin溶液為底物。取120 μL底物溶液和12 μL粗酶液，37 ℃恒溫水浴60 min，對照管用SAB緩沖液代替粗酶液。反應完畢后加入120 μL DNS 溶液終止反應，沸水浴5 min顯色后迅速冰浴冷卻，用SAB 緩沖液定容到500 μL，用酶標儀測定540 nm 波長處各樣品的吸光值，同時測定葡萄糖標準曲線的吸光值，根據測定結果計算EG和BG活性。每個反應體系重復3次。酶活力單位(U)與比活力(IU)定義同 1.2.4。

1.2.6 纖維二糖水解酶(CBH)的活性測定 CBH的活性測定以0.1 mol·L-1p-NPC為底物，取120 μL底物溶液和12 μL粗酶液，37 ℃恒溫水浴60 min，對照管用SAB 緩沖液代替粗酶液。反應完畢后加入120 μL 1 mol·L-1Na2CO3溶液終止反應，用SAB 緩沖液定容到500 μL，用酶標儀測定405 nm 波長處各樣品的吸光值，根據同時測定的p-NP標準曲線計算CBH活性。每個反應體系重復3次。酶活力單位(U)定義為在37 ℃、pH 5.6反應條件下，每分鐘水解底物產生1 μgp-NP的酶量；比活力(IU)定義同 1.2.4。

1.3 數據統計與分析

采用Excel 2010軟件進行酶活力和比活力計算，SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)及酶活性抑制作用的Duncan多重比較，統計數據以均值±標準誤(mean ± SE)表示。

纖維素酶活性抑制率(%)=(對照纖維素酶活性-氧化苦參堿處理后纖維素酶活性)/對照纖維素酶活性×100。

2 結果與分析

2.1 氧化苦參堿對臺灣乳白蟻FPA的影響

由表1可見，處理組FPA均低于對照，除處理后6 h的測定結果無顯著差異(F5=5.898,P=0.072)外，處理后12 h(F5=28.003,P=0.006)、1 天(F5=155.078,P<0.001)、3 天(F5=45.506,P=0.003)、5 天(F5=63.965，P=0.001)、7 天(F5=24.779,P=0.008)的測定結果均與對照差異極顯著。

2.2 氧化苦參堿對臺灣乳白蟻EG活性的影響

由表2可見，處理組EG活性均低于對照。處理后6 h(F5=13.013,P=0.023)、1天(F5=19.475,P=0.012)，處理組測定結果與對照差異顯著；處理后12 h(F5=62.058,P=0.001)、3天(F5=33.333,P=0.004)、5天(F5=77.212,P=0.001)、7天(F5=122.283,P<0.001)，處理組測定結果與對照差異極顯著。

2.3 氧化苦參堿對臺灣乳白蟻BG活性的影響

由表3可見，處理組BG活性均低于對照。處理后6 h(F5=9.282,P=0.038)、1天(F5=11.558,P=0.027)、3天(F5=18.868,P=0.012)，處理組測定結果與對照差異顯著； 處理后12 h(F5=66.627,P=0.001)、5天(F5=54.559,P=0.002)、7天(F5=342.264,P<0.001)，處理組測定結果與對照差異極顯著。

2.4 氧化苦參堿對臺灣乳白蟻CBH活性的影響

由表4可見，處理組CBH活性均低于對照。除處理后6 h的測定結果無顯著差異(F5=2.148,P=0.217)外，處理后12 h(F5=10.915,P=0.030)、1 天(F5=8.522,P=0.043)、3 天(F5=10.196,P=0.033)、5 天(F5=12.972,P=0.023)、7 天(F5=16.830,P=0.015)的測定結果均與對照差異顯著。

表1 氧化苦參堿對臺灣乳白蟻FPA的影響Tab.1 Effect of oxymatrine on FPA of C. formosanus

①*表示0.05水平下與對照差異顯著，**表示0.01水平下與對照差異顯著，下同。* indicated the significant difference with control at 0.05 level. **indicated the significant difference with control at 0.01 level.The same below.

表2 氧化苦參堿對臺灣乳白蟻EG活性的影響Tab.2 Effect of oxymatrine on EG activity of C. formosanus

表3 氧化苦參堿對臺灣乳白蟻BG活性的影響Tab.3 Effect of oxymatrine on BG activity of C. formosanus

表4 氧化苦參堿對臺灣乳白蟻CBH活性的影響Tab.4 Effect of oxymatrine on CBH activity of C. formosanus

2.5 氧化苦參堿對臺灣乳白蟻纖維素酶活性抑制率的影響

氧化苦參堿對臺灣乳白蟻FPA、EB、BG、CBH酶活性的抑制率見表5，整體表現為FPA>EG≥BG>CBH。除3 天及5 天的EG抑制率、3 天 BG抑制率、12 h CBH抑制率外，整體抑制效果均隨處理時間的延長而增強。

本研究表明，氧化苦參堿對臺灣乳白蟻的纖維素酶活性具有抑制作用，對FPA和EG、BG、CBH活性均有一定的抑制效果，其中最大抑制率為 5 天 的FPA 抑制率53.76%±4.86%，分別高于7天 的EG、BG 和 5天 的 CBH 活性最大抑制率33.62%±1.39%、34.37%±0.70%、22.59%±4.01%，說明氧化苦參堿對于纖維素酶系統整體抑制效果更明顯。

表5 氧化苦參堿對臺灣乳白蟻纖維素酶活性抑制率的影響①Tab.5 Effect of oxymatrine on cellulase inhibition rate of C. formosanus

①同一列不同字母表示0.05水平差異顯著。Different letters in same column mean significant difference at 0.05 level.

2.6 氧化苦參堿對臺灣乳白蟻質量和死亡率的影響

表6可見，對照組和處理組白蟻的初始質量無顯著差異(F5=0.165,P=0.705)，處理7 天后，處理組的質量顯著低于對照組(F5=1 075.109,P<0.001)，其死亡率顯著高于對照組(F5=78.400,P=0.001)。處理組白蟻的活動水平弱于對照組。

表6 氧化苦參堿對臺灣乳白蟻質量和死亡率的影響Tab.6 Effect of oxymatrine on the mass and mortality of C. formosanus

3 討論

白蟻已進化出獨特而高效的消化系統，能夠依靠自身和共生微生物分泌的纖維素酶降解食物中的纖維素類成分(Nakashimaetal., 2002； 楊天賜等， 2006)，低等白蟻可借以維持全部的生長發育需求(Watanabeetal., 2010)。目前，化學防治仍然是白蟻最普遍、最主要的防治方法，但對白蟻安全防治技術的探索從未停止，其中包括植物源白蟻藥劑的研究(Chouvencetal., 2011)。纖維素酶具有廣譜或專性的抑制劑，廣泛存在于自然界中(Mandelsetal.,1965)，因此，尋找天然纖維素酶抑制劑，通過抑制纖維素酶活性干擾白蟻新陳代謝，達到防治目的，是一種值得探索的防治理念。

氧化苦參堿和苦參堿作為從豆科植物苦參中提取的喹嗪啶類生物堿，具有顯著的生物活性，在醫學、農業上已得到了廣泛應用。在植物體內氧化苦參堿為較穩定的天然存在形式，其與苦參堿在提取后也存在著相互轉化(Luetal.,1996； 羅萬春等， 1997)。氧化苦參堿和苦參堿對于昆蟲的乙酰膽堿酯酶活性有明顯的抑制作用和拒食活性(羅萬春， 1995)，Du等(2004)研究表明苦參堿對棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)鈉通道具有濃度依賴性阻滯作用，但目前并無闡明氧化苦參堿對于纖維素酶消化的抑制作用機制是使蛋白變性或抑制分泌，因此苦參提取物的作用機制還有待進一步研究。

4 結論

氧化苦參堿對白蟻具有一定的胃毒作用，本研究結果說明氧化苦參堿對纖維素酶活性的抑制是其作用機制之一。研究表明白蟻取食量隨著氧化苦參堿濃度的提高而減少，高濃度氧化苦參堿將引起白蟻取食量顯著降低(Maoetal., 2007)，氧化苦參堿濃度太低在實際應用中將影響防治效果，0.1%～1%的氧化苦參堿可能是適宜的應用濃度。因此，將苦參植物提取物與誘食餌料結合，可研制白蟻抑食劑及消化干擾劑，作為誘殺餌劑應用于白蟻的防治。

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(責任編輯 朱乾坤)

Inhibitory Effect of Oxymatrine on Cellulase Activity ofCoptotermesformosanus(Isoptera: Rhinotermitidae)

Gu Daifei1Yan Shanchun1Li Zhiqiang2

(1.CollegeofForestry,NortheastForestryUniversityHarbin150040; 2.GuangdongPublicLaboratoryofWildAnimalConservationandUtilizationGuangdongKeyLaboratoryofAnimalConservationandResourceUtilizationGuangdongInstituteofAppliedBiologicalResourcesGuangzhou510260)

【Objective】The formosan subterranean termite,Coptotermesformosanus(Isoptera: Rhinotermitidae), is one of important wood-feeding pest in China. To protect the ecological environment and reduce the use of the chemical pesticide in Taiwan termite prevention, it is urgently needed to search for alternative ingredients in place of the persistent organic pollutants (POPs) of the pesticide. This study investigated oxymatrine, from plants, with insecticidal activity that has inhibitory effect on cellulase activity of Taiwan termite workers, in order to provide the basis for the application of oxymatrine in the termite prevention and control.【Method】In this study, the workers ofC.formosanusstarved for 2 d were fed by 1% oxymatrine treated filter paper were investigated under laboratory conditions [temperature, (26±1) ℃, relative humidity, 65%±5%, in the dark]. In 6 h,12 h,1 d,3 d,5 d,7 d after treatment, digestive tracts of Taiwan termite ants were collected and the protein content was determined using the Coomassie Brilliant Blue G-250, and the filter paper activity (FPA), endo-β-1,4-glucanases (EG), β-glucosidase (BG), and cellobilohydrolase (CBH) activities were assayed using the dinitrosalicylic acid method. 【Result】 The results showed that 1% oxymatrine had significant inhibitory effect on filter paper activity(FPA)and the activities of endo-1,4-β-glucanase (EG)，β-1,4-D-glucosidase (BG) and cellobilohydrolase (CBH) except for the activity of FPA and CBH in 6 h. The average cellulase inhibition rate was FPA>EG≥BG>CBH. Cellulase inhibition rate increased with the extension of treatment time, except for the EG inhibition rate in 5 d, BG inhibition rate in 3 d, and CBH inhibition rate in 12 h. Activity ofC.formosanusworkers exposed to 1% oxymatrine for 7 days was weakened significantly. The weight of the treated termite workers was significantly decreased compared with the control group, and the termite mortality was significantly increased.【Conclusion】 This study determined that 1% oxymatrine had significant inhibitory effect on cellulas activity ofC.formosanus, indicating that the inhibition of cellulase activity is one of the mechanisms of oxymatrine on insecticidal activity. Oxymatrine has chronic lethal activity onC.formosanus. The use of oxymatrine in suppressing cellulose digestibility ofC.formosanusis a worth exploring methods of prevention ofC.formosanus.

Coptotermesformosanus； oxymatrine； cellulase； inhibition

10.11707/j.1001-7488.20170210

2016-04-12；

2016-09-06。

廣東省自然科學基金(2015A030310429)； 廣州市科技計劃項目(201510010036)； 廣東省科學院重大科技產出規劃專項(zdccyd201307)。

S718.7

A

1001-7488(2017)02-0083-06

*嚴善春為通訊作者。