降鈣素基因相關肽參與調節Th17和Treg細胞分化

劉文宣，楊 磊，劉文聰，姚智燕，李 濤，蘇 鵬

(1.河北醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計學教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫科大學第一醫院超聲科，河北 石家莊 050031；3.河北醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，河北 石家莊 050017；4.遼寧省遼陽市中心醫院胸外科，遼寧 遼陽 111000)

·論 著·

降鈣素基因相關肽參與調節Th17和Treg細胞分化

劉文宣1，楊 磊1，劉文聰2，姚智燕3，李 濤1，蘇 鵬4*

(1.河北醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計學教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫科大學第一醫院超聲科，河北 石家莊 050031；3.河北醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，河北 石家莊 050017；4.遼寧省遼陽市中心醫院胸外科，遼寧 遼陽 111000)

目的研究降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)對人外周血中Th17(IL-17 producing T cell)和Treg(regulatory T cell)細胞分化的調節作用。方法采用免疫磁珠法(magnetic activated cell sorting，MACS)分離人外周血中CD4+CD45RA+T細胞，即初始CD4+T細胞，在一定條件下分別體外誘導其向Th17細胞和Treg細胞分化，之后用流式細胞術測定Th17和Treg細胞所占比例；用實時定量RT-PCR方法檢測Th17和Treg細胞分化的特異性轉錄因子維甲酸相關核孤兒受體γt(orphan nuclear receptor γt，RORγt)和轉錄因子FoxP3 (foxhead box protein 3)mRNA的表達水平；用酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測Th17細胞上清中IL-17A的含量，進而從多個方面探討CGRP對Th17和Treg細胞分化的影響。結果CGRP可劑量依賴性增加Th17細胞所占的比例和RORγt mRNA的表達水平(P<0.05)；另外，CGRP也促進了IL-17A的分泌(P<0.05)。同時，CGRP能劑量依賴性抑制Treg細胞所占的比例和FoxP3 mRNA的表達(P<0.05)。結論CGRP可促進人外周血中初始CD4+T細胞向Th17細胞分化，而抑制其向Treg細胞分化。

降鈣素；Th17細胞；T淋巴細胞，調節性

Th17(IL-17 producing T cell)細胞表達特異性轉錄因子維甲酸相關核孤兒受體γt(orphan nuclear receptor γt，RORγt)因其可分泌白細胞介素(interleukin，IL)17而命名，該細胞通過促進炎癥反應的發生，參與多種自身免疫性疾病的免疫應答[1]。Treg細胞(regulatory T cell)雙表達CD25和轉錄因子FoxP3(foxhead box protein 3)，主要作用表現為抑制抗原呈遞細胞的功能、抑制T細胞增殖及促炎性細胞因子分泌[2]。可見，Th17和Treg細胞在功能上表現出互相抑制的特點，分化發育方面亦是如此。但研究表明，二者的分化平衡在多種疾病，如自身免疫性疾病及炎癥性疾病的發病中發揮重要作用[3]。降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)是Rosenfeld等1983年在神經組織內發現的一種由37個氨基酸殘基組成的多功能生物活性多肽，廣泛分布于機體中樞、外周神經系統以及淋巴器官的神經末梢中，對機體多個臟器和系統的功能具有重要的調節作用，如CGRP作為一種免疫調節肽，在免疫調節方面發揮重要作用。最近的研究結果顯示，CGRP通過抑制抗原提呈細胞的功能進而抑制Th1細胞分化及γ干擾素分泌，同時促進Th2細胞分化及IL-4分泌[4-5]。為了對CGRP的免疫調節功能有更全面的了解，本研究擬探索CGRP對Th17和Treg細胞分化是否具有調節作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 LEAFTM-purified anti-human CD3(OKT3)和LEAFTM-purified anti-human CD28(CD28.2)購于Biolegend(San Diego，CA)公司；人重組TGF- β1、人重組IL-2、人重組IL-6、人重組IL-1 β和人重組IL-23購于 R&D(Lille，France)公司；CGRP購于Cayman Chemical(Ann Arbor，MI)公司；PCR引物購于上海生工生物科技公司；反轉錄及實時定量PCR試劑盒(SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit)購于TaKaLa公司；FITC anti-human CD4、FITC anti-human CD25(2A3)、PE anti-human FoxP3(259D/C7)、PE anti-human IL-17A(N49-653)等抗體及流式細胞檢測所需細胞破膜劑、固定劑等試劑均購于 BD(San Diego，CA)公司。

1.2 細胞的制備 Ficoll密度梯度離心法制備外周血單個核細胞，使用CD4+CD45RA+磁珠分離試劑盒分選初始 CD4+T細胞，流式細胞術鑒定純度>95%。

1.3 T細胞培養及誘導分化方案 收集分選初始 CD4+T細胞，用RPMI 1640培養基(含10%熱滅活胎牛血清，青霉素/鏈霉素100 U/ mL)重懸，調整細胞濃度為1×105個/mL，接種于用anti-CD3抗體(濃度為5 mg/L)預先包被的24孔U形板中，之后使用不同方法誘導培養Th17和Treg細胞：加入CD28抗體(終濃度為2 mg/L)、轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)(終濃度為5 μg/L)、IL-6(終濃度為20 μg/L)、IL-1β(終濃度為20 mg/L)及IL-23(終濃度為25 μg/L)刺激培養Th17細胞；加入CD28抗體(終濃度為2 mg/L)、TGF-β1(終濃度為5 μg/L)、IL-2(終濃度為500 U/mL)刺激培養Treg細胞，37 ℃、5%CO2培養7 d。以上述誘導方案培養的細胞為單純誘導組，即對照組；以在單純誘導方案的基礎上加入不同濃度CGRP(終濃度分別為10-9、10-8、10-7、10-6mol)的細胞作為實驗組，通過比較檢測不同濃度的CGRP對Th17和Treg細胞分化是否具有調節作用。

1.4 胞內染色和流式檢測方法 Th17細胞的胞內染色方法：磁珠分選的初始 CD4+T細胞，采用上述分組方式，按照上述Th17細胞誘導分化方法培養細胞，7 d后收集各組細胞，加入CD4抗體37℃避光孵育30 min，之后加入佛波酯(PMA，終濃度為50 μg/L)、離子霉素 (ionomycin，終濃度為1 μmol)和0.7 μL蛋白轉運抑制劑(BD GolgistopTM)繼續37 ℃避光孵育4 h。使用固定劑、破膜劑處理細胞之后，加入IL-17A抗體室溫避光孵育45 min。最后，流式細胞儀上機檢測各組細胞中CD4+IL-17+T細胞，即Th17細胞所占比例。Treg細胞的胞內染色方法：磁珠分選的初始 CD4+T細胞，采用上述分組方式，按照上述Treg細胞誘導分化方法培養細胞，7 d后收集各組細胞，加入CD25抗體室溫避光孵育30 min，用固定劑、破膜劑處理細胞之后，加入FoxP3抗體并室溫避光孵育45 min。最后，流式細胞儀上機檢測各組細胞中CD25+FoxP3+T細胞，即Treg細胞所占比例。

1.5 RNA提取和實時定量RT-PCR 磁珠分選的初始 CD4+T細胞，采用上述分組方式，按照上述Th17和Treg細胞誘導分化方法培養細胞，7 d后收集各組細胞，提取細胞的全基因組RNA，經逆轉錄合成cDNA，取2 μL cDNA為模板，使用SYBR Green PCR Master Mix進行目的片段擴增，引物序列如下。RORγt F:5′-CTCAAAGCAGGAGCAA-TGGAAGT-3′,RORγt R:5′-GGAGTGGGAGAA-GTCAAAGATGGA-3′； FoxP3 F:5′-CATCCGCC-ACAACCTGAGTCTGC-3′,FoxP3 R:5′-CCTG-TTCGTCCATCCTCCTTTCCT-3′;β-actin F:5′-GTCACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3′,β-actin R:5′-CTTAGTTGCG -TTACACCCTTTCTT-3′。采用實時定量RT-PCR方法檢測各組細胞中RORγt mRNA和 FoxP3 mRNA的相對表達水平，結果以待測基因/β-actin的Ct比值表示。

1.6 酶聯免疫吸附測定法檢測IL-17A水平 磁珠分選的初始 CD4+T細胞，采用上述分組方式，按照上述Th17細胞誘導分化方法培養細胞，7 d后收集各組細胞上清，用酶聯免疫吸附測定法試劑盒檢測上清液中IL-17A蛋白水平，具體操作參照試劑說明書。

1.7 統計學方法 應用SPSS 16.0軟件進行分析，計量資料比較分別采用t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 誘導前后Th17和Treg細胞比較 誘導分化后細胞中含Th17細胞和Treg細胞較誘導分化前明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 不同時點間RORγt和FoxP3的表達 隨著培養時間的延長，RORγt和FoxP3 mRNA的表達逐漸升高，在第7天時表達量達高峰，誘導后第3天、第5天、第7天與誘導前比較差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表1 誘導初始CD4+T 細胞向Th17和Treg細胞分化

檢測時間Th17細胞Treg細胞誘導分化前0.24±0.051.14±0.26誘導分化后5.76±0.1928.86±3.21t48.66214.911P0.0000.000

表2 RORγt和FoxP3 mRNA表達具時間依從性

檢測時間RORγtmRNAFoxP3mRNA誘導前1.00±0.001.00±0.00第1天2.19±0.360.82±0.08第3天3.63±0.49*6.49±1.10*第5天7.68±0.91*11.77±1.08*第7天12.95±1.31*15.84±1.16*F122.203170.951P0.000.00

*P<0.05與誘導前比較(SNK-q檢驗)

2.3 不同濃度CGRP對Th17細胞、RORγt mRNA和IL-17A的影響 誘導培養7 d后結果顯示，隨著CGRP濃度的增加，Th17細胞、RORγt RNA和IL-17A均呈逐漸升高，Th17細胞在CGRP10-7mol和CGRP-6mol、RORγt mRNA和IL-17A在CGRP10-8mol、CGRP-7mol、CGRP-6mol時內表達與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.01)，見表3。

2.4 不同濃度CGRP對Treg細胞和FoxP3的影響 隨著CGRP濃度的增加，Treg細胞和FoxP3 mRNA的表達逐漸降低，在CGRP10-8mol、CGRP-7mol和CGRP10-6mol濃度時的表達與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.01)，見表4。

表3 CGRP對Th17細胞分化的影響

組別 Th17細胞(%)RORγtmRNA(fold)IL-17A(ng/L)對照組 5.76±0.191.00±0.00125.55±7.63CGRP(10-9mol)6.65±0.321.09±0.08159.45±8.12CGRP(10-8mol)7.96±0.391.30±0.03*188.17±10.12*CGRP(10-7mol)8.46±0.48*1.46±0.05*209.91±11.55*CGRP(10-6mol)9.54±0.89*1.54±0.07*246.45±15.10*F 25.40254.45154.782P 0.0000.0000.000

*P<0.05與對照組比較(SNK-q檢驗)

表4 CGRP對Treg細胞分化的影響

組別 Treg細胞(%)FoxP3mRNA(fold)對照組 28.86±3.211.00±0.00CGRP(10-9mol)22.31±5.150.91±0.04CGRP(10-8mol)15.83±6.74*0.74±0.08*CGRP(10-7mol)13.75±5.93*0.56±0.09*CGRP(10-6mol)11.19±4.78*0.28±0.06*F 5.48262.820P 0.010<0.05

*P<0.05與對照組比較(SNK-q檢驗)

3 討 論

Th17 和 Treg細胞的分化平衡在自身免疫性疾病及炎癥相關疾病，如在類風濕性關節炎的發生發展中起重要作用[6]。Th17 和 Treg細胞都是由Th0細胞分化而來的，Th17 細胞具有明顯的促炎作用，而 Treg細胞具抗炎性能，二者在功能上互相拮抗，在分化過程上互相抑制，但有一定的相關性：當機體處在穩定狀態下，抗原提呈細胞分泌的TGF-β促進Th0向Treg細胞分化，同時IL-2的存在可促進Treg細胞的進一步增殖；而機體在感染或炎癥狀態時，體內大量分泌IL-6和IL-1β，二者與抗原提呈細胞分泌的TGF-β一起共同誘導Th0向Th17細胞分化，同時IL-23的存在可促進Th17細胞的進一步增殖。本研究應用免疫磁珠法分選初始 CD4+T細胞，使用anti-CD3、anti-CD28抗體、TGF-β1、IL-6、IL-1β及IL-23培養7 d, 成功誘導了Th17細胞的分化；使用anti-CD3、anti-CD28抗體、TGF-β1及IL-2培養7 d, 成功誘導了Treg細胞的分化。此方法與文獻報道一致[7-8]。同時還研究了在誘導過程中，Th17和Treg細胞的特異性轉錄因子RORγt和FoxP3 在mRNA水平的表達情況，結果表明RORγt mRNA和FoxP3 mRNA的表達量均隨誘導培養時間的延長而表達量逐漸增加，在7 d時表達量達高峰。與文獻報道一致[7-8]。Th17和Treg細胞誘導模式的成功為本研究提供了基礎平臺。

CGRP作為免疫調節肽，具有多種免疫調節作用。如CGRP可以抑制T細胞增殖、存活及IL-2的分泌[9]；CGRP可抑制脂多糖誘導的樹突狀細胞分泌TNF-ɑ、 IL-12等促炎性細胞因子[4]；CGRP可抑制樹突細胞成熟、抑制樹突狀細胞和巨噬細胞遷移、抗原呈遞及其活化T細胞的功能[10]，并通過抑制樹突狀細胞的功能進而抑制Th1細胞分化及INF-γ分泌，而促進Th2細胞分化及IL-4分泌[4-5]；另外，CGRP還可促進Th9細胞分化及IL-9分泌[11]。可見，CGRP作為一種重要的調節介質參與了T細胞分化。本研究結果顯示，CGRP增加了人外周血CD4+T細胞中RORγt mRNA的表達及Th17細胞所占的比例，可見CGRP可促進初始CD4+T細胞向Th17細胞分化。另外，本研究又測定了各組Th17細胞培養上清中的IL-17A含量，結果表明CGRP也顯著促進了IL-17A分泌。說明CGRP不僅促進了Th17細胞的分化，其對Th17細胞的功能也具有調節作用。同時，CGRP下調了人外周血來源的CD4+T細胞中FoxP3 mRNA的表達及Treg細胞所占的比例，也就是說，CGRP可抑制初始CD4+T細胞向Treg細胞分化。CGRP可與一些炎性細胞、免疫細胞等相互作用，參與調節機體炎癥反應。有研究表明，在體內，CGRP通過調節樹突狀細胞、T細胞的功能參與接觸性皮炎[5]、卵白蛋白誘導的超敏反應[12]、過敏性支氣管哮喘[13]等一系列免疫性炎癥過程；CGRP還可通過影響免疫細胞分泌IL-1β、TNF-α和 IL-6，而在類風濕性關節炎的發病中發揮重要作用[14]。令我們感興趣的是，最近有研究發現CGRP可以通過調節IL-17的表達而促進Th17細胞介導的實驗性自身免疫性腦脊髓炎發生[15]。看來，CGRP作為免疫調節肽，參與了多種疾病的發生發展。

綜上所述，CGRP對人外周血中Th17和Treg細胞分化均有調節作用，接下來的研究中，將建立膠原誘導的關節炎小鼠模型，進一步確定CGRP是否可以通過調節Th17和Treg細胞分化平衡參與類風濕性關節炎的發生，從而為類風濕性關節炎發病機制的研究提供新的思路。

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(本文編輯：劉斯靜)

Calcitonin gene related peptide participate in the regulation of Th17 and Treg differentiation

LIU Wen-xuan1, YANG Lei1, LIU Wen-cong2, YAO Zhi-yan3, LI Tao1, SU Peng4*

(1.DepartmentofEpidemiologyandStatistics,SchoolofPublicHealth，HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China；2.DepartmentofUlstrasound,theFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031,China；3.DepartmentofImmunology,InstituteofBasicMedicine,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China; 4.DepartmentofThoracicSurgery,theCentralHospitalofLiaoyangCity,Liaoyang111000,China)

Objective To dissect the role of calcitonin gene related peptide(CGRP) on IL-17 producing T cell(Th17) and regulatory T cell(Treg) differentiation. Methods Naive CD4+T cells were isolated from human peripheral blood by magnetic activated cell sorting(MACS) selection, and cultured under Th17-polarizing and Treg-polarizing condition, The proportion of Th17 cells and Treg cells were detected by flow cytometry, the relative expression levels of retionid-related orphan nuclear receptor γt(RORγt) mRNA and foxhead box protein 3(FoxP3) mRNA were measured by real-time RT-PCR. In addition, we detected the production of IL-17A by enzyme-linked immunosorbent assay, we explored the effects of CGRP on the differentiation of Th17 and Treg cells form Several aspects. Results CGRP increased the proportion of Th17 cells and the expression of RORγt mRNA(P<0.05). Additionally, CGRP also increased the production of IL-17A(P<0.05), these effects of CGRP were in dose-dependent manner. Meanwhile, CGRP inhibited the percentage of Treg cells and the expression of FoxP3 mRNA also in dose-dependent way(P<0.05), peaking at 10-6M. Conclusion These results demonstrate that CGRP facilitates naive CD4+T cells from human peripheral blood differentiate to Th17 cells, but suppresses them differentiate to Treg cells.

calcitonin; Th17 cells ；T-lymphocytes, regulatory

2016-11-18；

2017-01-04

河北省高等學校科學研究計劃(QN2015006)；河北省醫學科學研究重點課題(20150626，20150631)

劉文宣(1983-)，女，河北欒城人，河北醫科大學公共衛生學院副教授，醫學博士,從事類風濕性關節炎免疫機制研究。

*通訊作者。E-mail:76654228@qq.com

R392.9

A

1007-3205(2017)03-0326-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.03.019