蜘蛛香中綠原酸及總酚酸的含量測定

劉開萍+楊軍+羅喜榮+趙開坤+尹航+劉興賦

摘要：試驗建立了蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）中綠原酸和總酚酸的含量測定方法。利用高效液相色譜法（HPLC）測定蜘蛛香中綠原酸的含量，色譜柱為Dikma C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.4%磷酸水溶液（12∶88），流速1.0 mL/min，檢測波長327 nm，柱溫30 ℃；以綠原酸為對照品，采用紫外-可見分光光度法（UV）在327 nm波長處測定蜘蛛香中總酚酸的含量。結果表明，綠原酸在2～20 μg/mL范圍內濃度與峰面積線性關系良好，r=0.999 6，加樣回收率為97.95%，RSD為1.37%；總酚酸在5～20 μg/mL范圍內濃度與吸光度線性關系良好，r=0.999 8，加樣回收率為100.31%，RSD為1.34%。該方法簡便、快速、準確、重復性好，可用于蜘蛛香中綠原酸和總酚酸的含量測定。

關鍵詞：蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）；綠原酸；總酚酸

中圖分類號：Q949.781.4+7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）02-0288-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.02.021

蜘蛛香又名馬蹄香、老虎七、心葉纈草等，系敗醬科（Valerianaceae）纈草屬（Valeriana L.）植物蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）的干燥根莖及根，在中醫里具有理氣止痛、消食止瀉、祛風除濕、鎮靜安神等功效，主治脘腹脹痛、食積不化、腹瀉痢疾、風濕痹痛、腰膝酸軟、失眠等癥，主要含有揮發油、纈草三酯類、黃酮類、多酚類等成分[1-8]。蜘蛛香藥材的質量控制目前尚不完善，為此，試驗分別采用高效液相色譜法（HPLC）和紫外-可見分光光度法（UV），首次測定了蜘蛛香植株中綠原酸及總酚酸的含量，旨在為蜘蛛香藥材資源的合理開發利用以及質量控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 蜘蛛香植株分別采自貴州省貴陽市、江口縣、松桃苗族自治縣、岑鞏縣、石阡縣，自然陰干后，粉碎過60目篩，備用。綠原酸對照品來自中國食品藥品檢定研究院，批號110753-201314；乙腈為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 主要有Agilent 1100 DAD高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；UV-1750紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；EL204電子天平（梅特勒-托利儀器上海有限公司）；KQ5200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）。

1.2 溶液的配制

1.2.1 對照品溶液 精密稱取適量綠原酸對照品，用50%甲醇配成200 μg/mL的貯備液。分別取不同體積的綠原酸標準貯備液于10 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，配制成系列濃度的標準工作溶液。

1.2.2 供試品溶液 準確稱取各地0.5 g蜘蛛香樣品，用石油醚回流脫脂至提取液無色，殘渣揮干石油醚后置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇50 mL，密塞，搖勻，稱定質量；超聲提取40 min，放冷，用50%甲醇補足減失的質量；過濾，取續濾液0.2 mL，加50%甲醇稀釋、定容至10 mL，即得。

1.3 綠原酸的測定

色譜柱為Dikma C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.4%磷酸水溶液（12∶88），流速1.0 mL/min，檢測波長327 nm，柱溫30 ℃，進樣量20 μL。以標準品的保留時間和峰面積定性、定量測定樣品中的綠原酸含量。

1.4 總酚酸的測定

以50%甲醇作空白，在紫外-可見分光光度計的最大吸收波長處測定標準工作溶液的吸光度，繪制工作曲線，以相同條件測定樣品液的吸光度，計算樣品中的總酚酸含量。

2 結果與分析

2.1 綠原酸測定

2.1.1 色譜分析 綠原酸對照品和供試品色譜結果見圖1。從圖1可見，在上述色譜條件下，綠原酸可有效分離，峰型對稱，無雜峰干擾。

2.1.2 標準曲線 精密移取綠原酸標準貯備液 0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，按上述色譜條件依次進樣，測定峰面積。以綠原酸濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸擬合，得回歸方程y=9.513 4x-0.380 5，r=0.999 6，表明綠原酸在2～20 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

2.1.3 精密度試驗 取同一供試品溶液，按上述色譜條件連續進樣6次，測得綠原酸峰面積RSD為0.92%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣，測得綠原酸峰面積RSD為1.43%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.5 重復性試驗 取同一批（貴陽市樣品）蜘蛛香樣品6份，先按上述方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件測定，測得綠原酸平均含量為20.53 mg/g，RSD為1.26%，表明該方法重復性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知綠原酸含量的蜘蛛香樣品6份，準確加入等量的對照品，按上述方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件測定，結果平均回收率為97.95%，RSD為1.37%，表明該方法準確度良好。

2.2 總酚酸測定

2.2.1 測定波長的選擇 分別取對照品溶液和供試品溶液在紫外-可見分光光度計的200～400 nm范圍內進行掃描，結果見圖2。圖2表明，對照品溶液及供試品溶液均在327 nm處有最大吸收，故選擇總酚酸測定波長為327 nm。

2.2.2 工作曲線 精密移取總酚酸標準貯備液 0.25、0.40、0.55、0.70、0.85、1.00 mL分別置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，在327 nm處測定吸光度。以總酚酸濃度為橫坐標（x），吸光度為縱坐標（y）繪制標準曲線，得回歸方程為y=41.867x-0.020 8，r=0.999 8，表明在5～20 μg/mL范圍內總酚酸濃度與吸光度具有良好的線性關系。

2.2.3 精密度試驗 取同一供試品溶液在327 nm處測定吸光度，重復測定6次，結果RSD為0.85%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h在327 nm處測定吸光度，結果RSD為1.04%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.5 重復性試驗 取同一批（貴陽市樣品）蜘蛛香樣品6份，按上述方法制備供試品溶液，在327 nm處測定吸光度，測得總酚酸平均含量為37.12 mg/g，RSD為1.15%，表明方法重復性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知總酚酸含量的蜘蛛香樣品6份，準確加入等量的對照品，按上述方法制備供試品溶液，在327 nm處測定吸光度，結果平均回收率為100.31%，RSD為1.34%，表明方法準確度良好。

2.3 樣品測定

取不同產地的蜘蛛香樣品，按上述方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件測定，計算樣品中的綠原酸含量；在紫外-可見分光光度計的327 nm處測定吸光度，計算樣品中的總酚酸含量，結果見表1。

3 討論

蜘蛛香是惟一被2015年版《中國藥典》收錄的纈草類生藥，是一味中醫臨床長期應用療效較好的中藥，具有抗腫瘤、保護神經、保肝、抗氧化、抗菌、抗病毒等藥理作用[9]。試驗建立了蜘蛛香中綠原酸及總酚酸含量的檢測方法，該方法簡單、快捷、重現性好、準確可靠，可用于蜘蛛香藥材的質量控制及定量分析，為蜘蛛香藥材質量標準的提升打下了基礎。

綠原酸廣泛分布于植物中，但含量較高的植物不多。試驗測定了黔產蜘蛛香中綠原酸及總酚酸的含量。結果表明，酚酸類化合物是蜘蛛香中含量較高的一類物質，是其發揮臨床療效的重要物質基礎，具有較高的研究和開發利用價值。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015.368-369.

[2] 楊 軍，龍慶德，羅喜榮，等.超臨界二氧化碳萃取蜘蛛香油工藝的研究[J].時珍國醫國藥，2012，23（1）：157-158.

[3] 田弋夫，龍慶德，羅喜榮，等.蜘蛛香油化學成分的氣相色譜-飛行時間質譜分析[J].時珍國醫國藥，2012，23（4）：924-926.

[4] 羅喜榮，羅 俊，楊 軍，等.蜘蛛香不同部位中總纈草三酯含量測定[J].安徽農業科學，2012，40（16）：8884，9106.

[5] 羅喜榮，苑天紅，楊 軍，等.超臨界CO2萃取蜘蛛香中總纈草三酯的工藝研究[J].廣東農業科學，2012（16）：119-121.

[6] 羅喜榮，苑天紅，楊 軍，等.超臨界CO2萃取蜘蛛香中纈草素工藝優化[J].湖北農業科學，2013，52（8）：1901-1902，1912.

[7] 李 蓉，李小平，吳 瑩.紫外分光光度法測定蜘蛛香中總黃酮的含量[J].遼寧中醫藥大學學報，2008，10（12）：149-150.

[8] 傅 亮，楚清脆，黃寶康，等.毛細管電泳-電化學檢測法測定蜘蛛香中多元酚類化合物[J].分析化學，2005，33（2）：161-164.

[9] 陳 暢，李韶菁，唐仕歡，等.蜘蛛香藥理研究進展[J].中國中藥雜志，2012，37（14）：2174-2177.