發酵調味飲料酵母菌的篩選及其發酵性能研究

范洪臣，劉天，鄭威，陳寧，辛嘉英

（1.哈爾濱商業大學食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業大學會計學院，哈爾濱 150076；3.哈爾濱商業大學生命科學與環境科學研究中心，哈爾濱 150076）

發酵調味飲料酵母菌的篩選及其發酵性能研究

范洪臣1＊，劉天2，鄭威3，陳寧3，辛嘉英1

（1.哈爾濱商業大學食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業大學會計學院，哈爾濱 150076；3.哈爾濱商業大學生命科學與環境科學研究中心，哈爾濱 150076）

從當地制作面包面泥中分離酵母菌，以產酒精和3-羥基丁酮為參考指標，通過三級篩選，篩選出一株適合發酵調味飲料用的產酒低、產香性能優的酵母SD-01。通過個體形態、菌落特征、生理生化分析，SD-01鑒定為釀酒酵母。將SD-01接入到麥汁培養基中，不同溫度下產3-羥基丁酮、酒精不同，其中26℃下發酵條件最好，其酒精量為0.98g/dL，3-羥基丁酮最高為0.97g/L。在26℃下研究了菌種生長、代謝還原糖、產酸、產酒、產3-羥基丁酮的規律，為發酵生產提供借鑒。最終篩選的酵母菌因其產酒低、3-羥基丁酮高加之發酵產生豐富的有機酸，為發酵調味飲料生產提供了一株發酵性能良好的酵母。

篩選；酵母；發酵調味飲料；酒精；3-羥基丁酮

近年來，傳統的碳酸飲料、新興的茶飲料、果汁飲料、蔬菜汁飲料、發酵調味飲料這些功能性飲料快速發展。其中，發酵調味飲料也不斷走向成熟，新技術不斷發展，迎合消費者口味和理念的新產品不斷涌現［1］。發酵調味飲料是一種飲料原料通過乳酸菌、酵母菌或其他允許使用的菌種發酵后調配，酒精含量在1%（體積分數）以下的飲料［2］。發酵調味飲料在發酵過程中微生物代謝產生很多小分子有機物，如有機酸、維生素等，這些有機物易于人體吸收，有利于人的身體健康，還具有抑菌作用，可以延長飲料的保質期［3］；同時酵母也具有廣泛的營養和應用價值，它具有高的蛋白質、完全的氨基酸、豐富的B族維生素、全面的生理活性物質如各種輔酶、細胞色素、凝血質、谷胱甘肽等［4］，酵母里的微量元素硒、鉻能抗衰老、抗腫瘤、預防動脈硬化，并能提高人體的免疫力，因此酵母菌對于發酵調味飲料來說相當重要。雖然酵母為發酵調味飲料帶入了諸多優點，但是也有其弊端，一是由于大多數酵母產酒能力較強，導致發酵結束后酒精含量較高，不符合發酵調味飲料的定義，后期對酒精的處理成為棘手的問題；二是風味不突出，雖然大多數酵母產生有機酸，但產香味物質較少，因此在發酵調味飲料調配中加入一些人工合成的香料彌補發酵調味飲料風味不足。隨著人們飲食習慣的改變，對人為合成的香料越來越排斥，因此篩選適合發酵調味飲料應用的產低酒精和高香味的酵母尤為重要。

目前大多數文獻報道集中在高產酒精酵母［5，6］、果酒類酵母［7－10］篩選上，單純篩選發酵調味飲料用酵母尤其是產酒精低、風味高的文章還沒見報道。2，3，5-氯化苯基四氮哇（TTC）平板法是篩選高產酒精酵母的常用方法，TTC作為顯色劑與酵母的代謝產物發生呈色反應，顏色深的菌株呼吸酶活力強，有較強的產酒精能力，進而判斷酵母產酒精能力的高低。本研究對TTC篩選高產酒精酵母的方法進行逆向思維，選擇顏色淺、呼吸酶弱、有較弱產酒能力的酵母。3-羥基丁酮也稱乙偶姻、甲基乙酰甲醇，主要應用于奶油、乳品、酸奶和草莓型飲料等食品行業。此外，3-羥基丁酮在化工、制藥、IT等行業也有廣泛應用。目前為止，化學法、酶法以及微生物發酵法是生產3-羥基丁酮的主要方法，在3種方法中，微生物發酵法憑借原料廣泛、反應條件溫和、綠色等優點而備受關注。3-羥基丁酮的測定原理是在堿性介質中，3-羥基丁酮與含胍基的化合物反應生成紅色化合物，甲萘酚促進紅色化合物生成，紅色化合物在可見光500～600nm有較強的光吸收，吸光值與3-羥基丁酮濃度在一定濃度范圍內成正比［11］。本研究根據測定3-羥基丁酮的原理，向發酵后的小玻璃管中加入3-羥基丁酮顯色劑，顏色深者為高產3-羥基丁酮菌株，利用此方法可以簡單、方便地篩選高產3-羥基丁酮酵母。通過3次篩選得到了酒精產量低、3-羥基丁酮含量高的酵母，對該酵母進行了初步鑒定并對其生產性能進行了研究，為篩選發酵調味飲料用酵母提供了方法借鑒，同時也為發酵調味飲料生產提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酵母菌種來源

酵母菌篩選材料來源于哈爾濱本地生產大列巴用的面泥。

1.1.2 一級篩選培養基

TTC上層培養基：參考文獻［12］TTC上層培養基配制。

TTC下層培養基：瓊脂15g，麥汁糖化液1000mL。

1.1.3 二級篩選培養基

麥汁糖化液。

1.1.4 三級篩選培養基

麥汁糖化液。

1.2 方法

1.2.1 富集培養

將面泥加入裝有100mL水及玻璃珠滅菌后的500mL錐形瓶中，用振蕩器振蕩1h，打碎面泥，釋放游離菌，振蕩后從菌懸液中取5mL樣品加入到滅菌后的含100μg/mL青霉素的麥汁中，26℃培養24h，鏡檢。若全為酵母則取1mL接入TTC篩選平板。

1.2.2 酵母菌的篩選

1.2.2.1 一級篩選

采用TTC法，將富集的酵母接入到TTC平板上，28℃培養48h，將TTC顯色劑覆蓋到底層培養基上生長的酵母菌落，繼續28℃培養16h。顏色的深淺代表產酒精能力，深紅色的酵母菌落產酒能力強，淺粉或無色產酒能力弱。將分離得到的各菌株根據上述方法試驗重復3次，初篩出產酒低性狀的酵母菌株。

1.2.2.2 二級篩選

將一級篩選得到的酵母接種到裝有麥汁培養基的玻璃試管中28℃培養48h，根據3-羥基丁酮測定原理，加入1mL 10%NaOH、0.5%肌酸、5%甲萘酚，4h后觀察試管顏色，顏色變紅的試管對應高產3-羥基丁酮菌株。將分離得到的各菌株根據上述方法試驗重復3次，篩選出高產3-羥基丁酮的菌株。

1.2.2.3 三級篩選

將二級篩選出的菌株按接種量6×106cfu/mL接入麥芽汁培養基中，28℃發酵48h后測定酒精和3-羥基丁酮含量，試驗重復3次，復篩得到性狀最為優良的菌株。

1.3 酵母菌的鑒定

形態特征鑒定：菌種個體形態和菌落特征。

生理生化試驗：根據《酵母菌的特征與鑒定手冊》［13，14］進行生理生化鑒定。

1.3.1 發酵性能的研究

不同溫度下產酒精能力的研究：將篩選出的菌株按接種量6×106cfu/mL接入麥芽汁培養基中，不同培養溫度22，26，30℃，發酵48h后測定酒精和3-羥基丁酮含量，考察不同溫度下該酵母的產酒精、3-羥基丁酮能力。

發酵性能的研究：將篩選出的菌株按接種量6×106cfu/mL接入麥芽汁培養基中，26℃下培養，發酵培養4，12，16，20，24，28h后測定該菌產酸、耗糖、產酒、產3-羥基丁酮指標。

1.3.2 測量方法

1.3.2.1 酒精的測定

酒精的測定采用GB/T 13662－2008方法測定。

1.3.2.2 3-羥基丁酮測定

3-羥基丁酮測定根據文獻［11］方法測定。

1.3.2.3 酸度測定

酸度用pH計直接讀數。

1.3.2.4 還原糖測定

還原糖用斐林試劑滴定法測定［15］。

2 結果分析

2.1 篩選結果

富集主要目的是將面泥中的酵母篩選出來，本實驗將采集的樣品置于100μg/mL青霉素麥汁培養基中，經培養將面泥中乳酸菌、醋酸菌等細菌淘汰，將酵母保留下來。

2.2 酵母菌的篩選

根據一級篩選的方法，及時觀察菌落的顏色變化，比較各菌株間的顏色深淺，其效果見圖1。

圖1 TTC平板篩選產低酒精酵母Fig.1The screening of low alcohol yeast on TTC plate

由圖1可知，平板中大多數酵母是紅色的，顏色較深，但有個別的酵母菌落顏色很淺，甚至無色，此類酵母菌同其他酵母相比菌落較小，呼吸酶可能較弱，有較弱的產酒能力，導致與TTC反應顏色較淺。通過一級篩選共得到48株酵母。

根據二級篩選的方法，及時觀察各菌管的顏色變化，比較各菌管的顏色深淺，其效果見圖2。

由圖2可知，菌種產3-羥基丁酮，可以根據玻璃試管粉顏色的深淺判斷，產3-羥基丁酮越多，粉顏色越深，最終由一級篩選方法挑選出的48菌株經二級篩選得到12株酵母，這12株酵母從一級、二級篩選效果看既產酒低又高產風味物質3-羥基丁酮。

根據三級篩選的方法以產酒、3-羥基丁酮為指標，選出了一株既產酒低又高產3-羥基丁酮的酵母，命名為HS-01，在7°Bix麥汁下發酵液酒精含量為0.96g/dL，比對照的商用產酒酵母產酒精含量2.56g/dL低很多，滿足了發酵調味飲料低酒精的要求。生成的風味物質3-羥基丁酮含量達到0.93g/dL。故經過三級篩選得到的HS-01完全達到了發酵調味飲料的要求。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 形態特征觀察

圖3 HS-01菌株的形態（40×10）Fig.3Figure of HS-01（40×10）

由圖3可知，在麥汁平板培養基25℃培養24h，經高倍顯微鏡觀察，HS-01為橢圓形，大小1.5～2.5μm× 2.5～8μm。

2.3.2 菌落特征

圖4 HS-01菌株菌落特征Fig.4Colony characteristics of strain HS-01

由圖4可知，HS-01菌株菌落顏色乳白色，挑起粘稠，外觀光滑、平整、有隆起。

2.3.3 生理生化鑒定

HS-01菌株能發酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖和棉子糖，不發酵乳糖；能同化棉子糖、麥芽糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、海藻糖、纖維二糖、乙醇、甘油、菊粉、D-甘露醇、α-甲基-葡萄糖苷、水楊苷、檸檬酸、琥珀酸；不能同化乳糖、D-木糖、D-核糖、蜜二糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、可溶性淀粉、乳酸、赤蘚醇、肌醇和核糖醇；不能同化硝酸鉀和亞硝酸鈉，鹽酸乙胺和鹽酸尸胺同化為陰性，在無維生素培養基上能生長，37℃能生長，50%葡萄糖能生長，產淀粉試驗為陰性。放線菌素酮抗性試驗為陰性。根據HS-01菌株的形態、生理生化試驗，結合《酵母菌的特征與鑒定手冊》，可將HS-01菌株鑒定為釀酒酵母。

2.4 HS-01酵母菌的發酵性能

為了確保篩選得到的菌株能夠用于發酵調味飲料實際生產，對酵母HS-01菌株的生長特性產酸、耗糖、產酒和產3-羥基丁酮能力進行研究，為發酵生產提供借鑒。

2.5 溫度對HS-01產酒精、3-羥基丁酮的影響

在22，26，30℃下HS-01產酒精、3-羥基丁酮能力見圖5和圖6。

圖5 不同溫度下HS-01產酒精能力Fig.5Alcohol production ability of HS-01 at different temperatures

圖6 不同溫度下HS-01產3-羥基丁酮能力Fig.6Acetoin production ability of HS-01 at different temperatures

由圖5可知，隨著溫度的升高，酒精含量呈先升后降的趨勢，酒精含量在26℃最高，達到了0.98g/dL。

由圖6可知，隨著溫度的升高，3-羥基丁酮含量呈先升后降的趨勢，3-羥基丁酮含量在26℃最高，達到了0.97g/L。從產酒結果看，在低溫22℃和高溫30℃時產酒能力較弱，低溫時酵母生長較慢導致酒精含量低，高溫時溫度影響了酵母中合成酒精的代謝酶類活性從而影響了產酒精能力。但從產3-羥基丁酮能力看，26℃產量最高，可能在26℃下合成3-羥基丁酮的酶類代謝活躍。綜合酒精和3-羥基丁酮這兩個指標，發酵溫度26℃對發酵生產更有力，有益于獲得香氣好、酒精度適合的發酵調味飲料。

2.6 HS-01產酸規律

圖7 HS-01產酸曲線Fig.7Acid yield curve of HS-01

由圖7可知，隨著發酵的進行，pH逐漸變低，尤其是在16～24hpH下降最快，在28hpH達到3.5。這說明HS-01在發酵過程中具有較強的產酸能力，通過品嘗，酸味較柔和，由此帶來良好的酸味，豐富了發酵調味飲料風味，為發酵調味飲料的后期調制和新產品開發提供了有利因素。

2.7 HS-01耗糖規律

圖8 HS-01耗糖曲線Fig.8The curve of HS-01sugar consumption

由圖8可知，隨著發酵時間的增長，還原糖含量不斷降低，其中在16～28h還原糖降速最快，綜合產酸曲線、產酒曲線和產3-羥基丁酮曲線，HS-01利用還原糖主要在這個階段合成了有機酸、酒精和3-羥基丁酮，所以耗糖速度較快。

2.8 HS-01產酒精規律

圖9 HS-01產酒精曲線Fig.9The curve of HS-01alcohol production

由圖9可知，隨著發酵時間的增長，酒精含量逐漸升高，尤其是在16～24h酒精含量升速最快，在28h達到0.98g/dL。

2.9 HS-01產3-羥基丁酮規律

圖10 HS-01產3-羥基丁酮曲線Fig.10The curve of HS-01acetoin production

由圖10可知，隨著發酵時間的增長，3-羥基丁酮含量逐漸升高，28h達到最高，為0.97g/L。3-羥基丁酮4h時開始出現，至28h基本結束，在16～28h生成速率增快，與菌體的生長、耗糖相對應，說明HS-01產3-羥基丁酮是隨著菌體的生長而產生的。由于HS-01原始菌株產3-羥基丁酮較高，可以考慮在將來的研究中用該菌種直接生產天然的香料3-羥基丁酮。

3 結論

從生產面包的面泥中利用三級篩選的方法得到了一株產酒精低、3-羥基丁酮高的酵母菌HS-01，通過對其發酵性能進行研究，HS-01在26℃時產酒精0.98g/dL，3-羥基丁酮0.97g/L，產酸也比較好，是一株能夠用于發酵調味飲料的良好菌種。經過生理生化鑒定HS-01為釀酒酵母。隨著發酵調味飲料的發展，國內飲料企業已將發酵菌種、發酵調味飲料的生產及新型發酵調味飲料的開發作為重點，因此，HS-01用于發酵調味飲料生產及開發新型發酵調味飲料產品是我們將來主要研究的內容。

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Screening of Yeast for Fermented Drink Production and Research on Yeast Fermentation Capability

FAN Hong-chen1＊，LIU Tian2，ZHENG Wei3，CHEN Ning3，XIN Jia-ying1
（1.Key Laboratory for Food Science ＆Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；2.College of Accounting，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；3.Center of Research and Development on Life Sciences and Environmental Sciences，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）

A strain of yeast named SD-01for fermented drink production is screened from the bread dough with different grades of maturity after three level screening.The content of alcohol and acetoin is determined by three level screening.SD-01is identified asSaccharomycescerevisiaeon the basis of morphological characteristics，colony morphology，physiological and biochemical tests.The result indicates that the optimal fermentation temperature is 26℃，with alcohol of 0.98g/dL and acetoin of 0.97g/L.The fermentation technique of metabolism reducing sugar，acid production，alcohol production，acetoin production is researched at 26℃.SD-01has low alcohol，high acetoin and rich organic acids，is feasible for fermented drink production.

screening；yeast；fermented drink；alcohol；acetoin

TS261.13

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.007

1000-9973（2017）03-0026-05

2016－09－09 ＊通訊作者

黑龍江省科技廳項目（GC12B403）

范洪臣（1978－），男，黑龍江哈爾濱人，助理工程師，博士，研究方向：食品科學。