黃漿水發酵生產SCP的菌種選配

車穎潔，郝林

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西晉中 030801）

黃漿水發酵生產SCP的菌種選配

車穎潔，郝林

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西晉中 030801）

以黃漿水為原料，采用液態發酵方式，選配適合其發酵生產單細胞蛋白（SCP）的菌種，進行單因素及正交試驗。結果表明：扣囊擬內孢霉（EndomycopsisfiburigerCICC31258）、解脂假絲酵母（Candida lipolyticaCICC32457）、產朊假絲酵母（CandidautilisCICC31268）、白地霉（Geotrichumcandidum linkSH501）是適合發酵黃漿水生產單細胞蛋白的優良菌種；菌種間的最佳發酵配比為白地霉（SH501）∶扣囊擬內孢霉（CICC31258）∶解脂假絲酵母（CICC32457）∶產朊假絲酵母（CICC31268）為2∶1∶1∶2或者3∶1∶1∶2。

大豆黃漿水；單細胞蛋白（SCP）；菌種配比

豆制品營養豐富，風味獨特，深受人民群眾的喜愛。據統計，2010年我國豆制品的投豆量達到9.753×105噸，國內豆制品生產企業每年黃漿水排放量達到300萬噸以上［1］。在豆腐壓榨到成型過程中，為了使豆腐獲得特定的含水量、彈性特征等，施加一定的壓力把多余的水分排出，使豆漿中的蛋白凝固成豆腐，分離出來的即壓濾廢水，又稱黃漿水［2］。經過對黃漿水進行檢測得知，其主要成分有維生素、礦物質、糖類、蛋白質、脂類、氨基酸、可溶性固形物等，其中BOD高達7400mg/L，COD高達10000mg/L，總氮（TN）和氨氮（NH3-N）也較高，屬于高濃度可生化性程度高的廢水。目前企業都采取生化處理方式，投資大且效率低［3，4］。黃漿水的資源化利用符合我國“建設資源節約型、環境友好型社會、大力發展循環經濟”的重要導向。

單細胞蛋白（SCP）是利用各種基質培養細菌、酵母菌、真菌、藻類等獲得的微生物蛋白，又稱為菌體蛋白。其本質是由蛋白質、碳水化合物、脂肪、核酸、維生素、無機物等組成的細胞質團。近年來成為關注的熱點，在飼料中SCP被作為一種重要的蛋白質增補劑來代替常規蛋白質［5，6］。Gao Yurong等利用熱帶假絲酵母在pH 5.5，30℃時發酵大豆蛋白廢水生產單細胞蛋白，蛋白量達到6.11g/L。張建斌等［7］在以甘蔗糖蜜作為發酵基質生產酵母單細胞蛋白的菌種選育中，經過搖瓶培養，篩選得到了一株總蛋白得率較高的啤酒酵母S9。德國慕尼黑餐廳出售的一種既像牛排又像豬脯的“神奇牛排”，實際上就是SCP。歐洲最大的人造肉食品公司Marlow生產的Quorn是當今唯一面向人類的SCP產品。在國外，已經開展了把SCP摻入餅干、點心等食品中以提高營養價值的試驗，但仍處于研究開發階段［8，9］。

本文從能夠有效利用黃漿水中營養成分且安全性好的工業菌種中選取扣囊擬內孢霉酵母（Endomycopsis fiburigerCICC 31258）、解脂假絲酵母（CandidalipolyticaCICC 32457）、產朊假絲酵母（CandidautilisCICC 31268）、白地霉（GeotrichumcandidumlinkSH501）4類菌種作為發酵黃漿水生產SCP的菌群［10－12］，進行了單菌種試驗及多菌種的正交試驗，以此來選擇出最佳的菌種配比，并對黃漿水的發酵工藝進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與原料

扣囊擬內孢霉（CICC31258）、產朊假絲酵母（CICC31268）、解脂假絲酵母（CICC32457），購于中國食品發酵工業研究院；白地霉（SH501），山西農業大學食品院微生物實驗室保藏菌種。大豆黃漿水：取自豆制品加工企業。

1.1.2 培養基

麥芽糖培養基：蛋白胨10g、麥芽糖20g、酵母膏5g、瓊脂15g、水1000mL，自然pH，在0.1MPa，121℃下滅菌20min。

馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）：去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000mL，煮沸30min，雙層紗布過濾，濾液中加2%葡萄糖，補充水分，加2%瓊脂，自然pH，在0.075MPa，115℃下滅菌30min。

1.2 儀器與設備

恒溫培養振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限公司；臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；BL-58A滅菌鍋 上海博迅實業有限公司；水平型超凈工作臺 上海力申科學儀器有限公司；電熱恒溫培養箱 北京市光明醫療儀器廠；電熱恒溫鼓風干燥箱 北京醫療設備廠。

1.3 方法及步驟

1.3.1 生長曲線的制作

分別將已選取的菌株進行活化，取活化好的菌種1環接入已配制好的100mL相應液體培養基中，在30℃，140r/min的恒溫培養振蕩器中培養12h后轉接100μL于另一新的100mL液體培養基中，繼續振蕩培養12h后即為種子液。

分別對4株菌種進行60h的培養測定，每2h進行測定1次，記錄數據，以便獲得其生長曲線，為選擇對數期的菌種提供依據［13］。

1.3.2 種子液的制備

取1環經過斜面培養基活化好的菌體接種到相應的已滅菌的100mL液體培養基中，在140r/min，30℃的恒溫培養振蕩器中培養至對數期時分別取100μL接入到新的100mL液體培養基中，繼續培養至對數期后即為種子液。

1.3.3 正交試驗

在進行菌株配比試驗時，首先進行單菌種發酵試驗，分別將4株菌的種子液在對數中期接入經過滅菌（115℃，0.075MPa，5min）冷卻后的100mL黃漿水中，用8層紗布封口，在恒溫培養振蕩器中于28℃，140r/min條件下培養24h，利用臺式離心機進行離心（4000r/min，20min）分離，然后在70℃烘箱中烘干至恒重，稱重［14，15］。

在單個菌種發酵試驗的基礎上，通過混合發酵對已選定的菌種進行正交試驗［16］，發酵所得SCP的產量作為確定菌種間最佳配比的標準，見表1。

表1 因素水平表Table 1Factors and levels table

根據試驗方差分析所得的比例進行驗證性試驗，即在28℃，140r/min，24h環境下培養，并對發酵后的黃漿水在4000r/min下離心20min，后在75℃干燥箱中烘干至恒重，記錄數據并對比。

2 結果與分析

2.1 菌種生長曲線

經過測定得各菌種的生長曲線見圖1。

圖1 各菌種的生長曲線Fig.1The growth curves of each specy

由圖1可知，A和B在10～30h時達到對數期，在20h時菌種的活力最高，因此是接入的最佳時期；C和D在10～20h左右達到對數期，在15h時其活力最高，此時接入最為合適。

2.2 菌種發酵結果

經過單個菌種發酵，分別得出不同菌種的單細胞蛋白的產量為：白地霉0.96g/dL、扣囊擬內孢霉酵母0.58g/dL、產朊假絲酵母0.15g/dL、解脂假絲酵母0.38g/dL；由各個菌種的產量結果可知，白地霉的產量最多，產朊假絲酵母的產量最少。

遵循單菌發酵的條件，對4種菌株進行四因素三水平的正交組合，試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2Results of the orthogonal experiment

由表2可知，理論上的最優組合為A3B1C1D1，A∶B∶C∶D為3∶1∶1∶1；由極差的大小可知，對SCP產量的影響大小因素為B＞D＞C＞A；即B的極差最大，說明扣囊擬內孢霉酵母的影響作用很大；其次是產朊假絲酵母，對SCP的產量影響也很大；再次是解脂假絲酵母；白地霉的極差最小，說明白地霉對產物結果的影響最小。

根據表2的結論進行方差分析，見表3。

表3 方差分析表Table 3Analysis of variance table

F檢驗結果表明：白地霉A和解脂假絲酵母C對SCP的產量有著顯著的影響；扣囊擬內孢霉酵母B和產朊假絲酵母D有著極顯著的影響；因此，各因素對試驗指標影響的主次順序為B＞D＞A＞C。

采用q檢驗法對各因素水平進行多重比較，見表4。

表4 各因素水平組合平均數多重比較（q法）Table 4Each factor level combination averages multiple comparisons（q test）

由表4可知，A因素中A2，A3差異不顯著，且均優于A1，因此，選擇A2或者A3均可；B因素中B1顯著優于B2，B3且差異顯著，因此選擇B1；C因素中C1顯著優于C2，C3且差異顯著，因此選擇C1；D因素中D2顯著優于D1，D3，且差異顯著，因此選擇D2。

由以上分析得知4個試驗因素的最優水平組合為A2B1C1D2或者A3B1C1D2，即白地霉∶扣囊擬內孢霉∶解脂假絲酵母∶產朊假絲酵母為2∶1∶1∶2或者3∶1∶1∶2。

根據正交分析的結果對兩種最佳配比即白地霉∶扣囊擬內孢霉∶解脂假絲酵母∶產朊假絲酵母為2∶1∶1∶2或者3∶1∶1∶2進行相同環境下的發酵驗證試驗，重復3次，取平均值作為結果。經過烘干稱重所得菌體的重量分別為1.102，1.076g/dL，比理論中的最佳比例下進行發酵的SCP產量分別高出14.7%和12.01%。

3 結論

通過對選取好的4株性能不同的菌株進行了單個發酵生產SCP研究，分別得出不同菌種的SCP的產量為：白地霉0.96g/dL、扣囊擬內孢霉酵母0.58g/dL、產朊假絲酵母0.15g/dL、解脂假絲酵母0.38g/dL。由此可知，白地霉的產量最多，其次是扣囊擬內孢霉，然后為解脂假絲酵母，產朊假絲酵母的產量最少。

在單因素的基礎上，通過正交試驗得知對SCP產量影響顯著的主次因素為扣囊擬內孢霉＞產朊假絲酵母＞白地霉＞解脂假絲酵母，并確定了菌種間發酵的最佳配比為白地霉（SH501）∶扣囊擬內孢霉（CICC31258）∶解脂假絲酵母（CICC32457）∶產朊假絲酵母（CICC31268）為2∶1∶1∶2或者3∶1∶1∶2，以這兩種比例進行混合接種發酵時SCP的產量最高。經過對4種菌株進行混合發酵得知，混合后的菌群所得SCP的產量比任意一株單菌發酵的SCP的產量都要高，在此條件下進行發酵所得的SCP產量明顯提高，并且經過發酵后的黃漿水明顯澄清，達到了廢水凈化的目的。說明利用不同特征的菌種進行混合發酵可以有效地利用黃漿水中的營養成分。

［1］刁寧寧，張建國.豆制品廢水資源化利用研究進展［J］.食品與發酵科技，2014，52（1）：21-22.

［2］王秋霜，應鐵進.大豆制品生產廢水綜合開發研究進展［J］.食品科學，2007，28（9）：595-598.

［3］謝國排.黃漿水的綜合利用探索［J］.中國釀造，2009（4）：129-130.

［4］趙冬梅，劉凌，張京健.豆制品生產中高濃度廢水的檢測與分析［J］.食品與發酵工業，2006，32（1）：68-71.

［5］翟瑞娟.單細胞蛋白的優點及應用［J］.中國衛生產業，2012，23（2）：168-170.

［6］唐鑫，陳卓然.豆制品生產中黃漿水的綜合應用［J］.農產品加工，2010（6）：67-70.

［7］張建斌，洪文榮.萬古霉素發酵廢渣固態發酵生產單細胞蛋白的研究［J］.工業微生物，2008（4）：19-23.

［8］竇全林，楊明祿，周小玲，等.單細胞蛋白在食品和飼料中的生產利用現狀及前景［J］.糧食與飼料工業，2013（10）：39-42.

［9］Handan U M，Nuri A，Faruk A.Effect of single cell protein as a protein source in drosophila culture［J］.Brazilian Journal of Microbiology，2002（33）：314-317.

［10］于磊娟.酵母菌群利用大豆蛋白廢水生產SCP的研究［J］.山東輕工業學院學報，2010（1）：15-26.

［11］岑沛霖，蔡瑾.工業微生物學［M］.北京：化學工業出版社，2000：81-83.

［12］曲靜然，劉玉，宋俊梅，等.豆腐廢水發酵生產白地霉的研究［J］.食品研究與開發，2005，26（3）：99-101.

［13］沈萍，陳向東.微生物學實驗［M］.北京：高等教育出版社，2007：241-242.

［14］Yu Jia，Yang Qian，Zhang Xiangdong，et al.Research on single cell protein production of solid and liquid waste from potato with trichoderma aureoviride［C］.Study on Biological Control and Bio-technology，2009，9（1）：74-78.

［15］雷曉燕.利用淀粉廠廢水生產單細胞蛋白的研究［J］.遼寧化工，2005，34（4）：151-153.

［16］王欽德，楊堅.食品試驗設計與統計分析［M］.北京：中國農業大學出版社，2011：253-288.

Selection of Strain Producing SCP Fermented by Yellow Slurry Water

CHE Ying－jie，HAO Lin
（College of Food Science and Engineering，Shanxi Agricultural University，Jinzhong 030801，China）

Strains are selected to produce fermented single cell protein（SCP）with yellow slurry water as liquid media.The results show that the fermentation strains which can make full use of proteins，fats and saccharides，includingEndomycopsisfiburiger（CICC31258），Candidalipolytica（CICC32457），Candida utilis（CICC31268），Geotrichumcandidumlink（SH501）.Use single factor and orthogonal experiments to get the best ratio ofGeotrichumcandidumlink（SH501），Endomycopsisfiburiger（CICC31258），Candida lipolytica（CICC32457）andCandidautilis（CICC31268）is 2∶1∶1∶2or 3∶1∶1∶2.

soybean yellow slurry water；single cell protein（SCP）；ratio of strains

TS261.13

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.006

1000-9973（2017）03-0022-04

2016－09－27

企業橫向聯合項目

車穎潔（1992－），女，碩士，研究方向：食品生物技術；郝林（1957－），男，教授，博士，研究方向：食品微生物學。