新型抗血小板靶標磷酸肌醇3-激酶β的研究進展*

唐 倩，徐穎倩，劉應杰，曾 雪 綜述，劉應杰 審校

(重慶醫藥高等專科學校藥學院 401331)

·綜述· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.040

新型抗血小板靶標磷酸肌醇3-激酶β的研究進展*

唐 倩，徐穎倩△，劉應杰，曾 雪 綜述，劉應杰 審校

(重慶醫藥高等專科學校藥學院 401331)

磷酸肌醇3-激酶；抗血栓治療靶標；血栓形成；心血管疾病；動脈剪切力

當血管壁受損時，人體會啟動止血途徑來保護損傷的血管，但是抗凝血因子超出了正常調控范圍，參與凝血的物質就會積聚于血管壁，導致病理性血栓形成。抗血小板藥是治療血栓的一類重要的藥物，其主要以血小板聚集過程中的某些關鍵物質或信號途徑作為治療靶標，下調血小板整合素αⅡbβ3(GPⅡbⅢa)的黏附功能，達到治療血栓的效果[1]。目前，抗血小板藥物在治療過程中，很可能抑制正常的止血途徑而引發出血性并發癥。在血管壁損傷處，血流剪切力明顯增加，而高血流剪切力又會進一步導致血小板的激活與血栓的形成[2]。為了達到抑制病理性血栓形成而不影響正常生理性止血的目的，可將血小板中響應高血流剪切力的特異性信號途徑(或者特異性物質)作為治療靶標，選擇性地下調高剪切力調控的血小板中整合素αⅡbβ3的黏附能力。在血小板被激活的信號途徑中，磷酸肌醇3-激酶β(PI3Kβ)會特異性地響應高血流剪切力而被激活，進而增強αⅡbβ3的粘附能力,促進血小板聚集，因此，PI3Kβ對于研發新型的抗血栓藥物極具潛在價值[3]。本文介紹了PI3Kβ參與并形成血栓的信號途徑，并歸納總結了PI3Kβ作為抗血小板治療靶標的研究成果，為以PI3Kβ為靶標治療血栓可進行的后續研究工作提供有力的參考價值。

1 PI3Kβ的結構及功能

PI3Kβ是異二聚體酶，由一個催化亞基和一個調控亞基組成，其中催化亞基與Src-同源體2(SH2)結構域相結合[4]。研究表明，PI3Kβ的激活與酪氨酸激酶相關，酪氨酸激酶通過酪氨酸磷酸化基序與PI3Kβ的SH2結構域相互作用，使調控亞基募集并激活催化亞基，從而激活PI3Kβ使其發揮作用，也有研究表明，PI3Kβ在血小板中可以通過G蛋白的G-β/γ亞基和酪氨酸磷酸肽的協同作用而被激活。PI3Kβ在血栓的形成過程中發揮了非常重要的作用，PI3Kβ能特異性地響應高血流剪切力，上調血小板整合素αⅡbβ3的黏附力和穩定性，促進動脈粥樣硬化破裂斑塊處的血小板聚集，導致血栓形成，并且有研究證實PI3Kβ抑制劑能有效地抑制血栓的形成而不影響正常的止血過程[5]。

1.1PI3Kβ促進血小板激活 當受損的血管壁暴露于纖維狀膠原時，血小板會與膠原黏附，然后被糖蛋白Ⅵ(GPⅥ)信號通路誘導活化，PI3Kβ會參與GPⅥ依賴性Ca2+信號通路及血小板的形成過程，應用PI3Kβ抑制劑能夠選擇性地抑制GPⅥ信號通路的下游事件，從而抑制血小板的激活[6]。有研究發現在PI3Kβ缺陷的血小板中，脂質第二信使磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)的產量減少，蛋白激酶B的活性也受到了強烈的抑制，而這兩種物質也參與了血小板的活化過程，因此，可以說明PI3Kβ在血小板激活中占據重要地位[7]。凝血酶與血小板表面的蛋白酶活化受體1(PAR1)結合，通過一系列信號通路提高血小板整合素αⅡbβ3的黏附能力，從而使血小板激活，PI3Kβ是凝血酶激活血小板下游信號通路中的重要物質，PI3Kβ信號通路與PAR1介導的血小板穩定聚集相關，運用PI3K抑制劑干預可減少PAR1介導的持續的血小板活化[8]。研究表明，PI3Kβ還參與了腺苷二磷酸(ADP)誘導的血小板活化，運用PI3Kβ抑制劑和單獨的PI3Kβ構型敲除的情況下，由ADP誘導的血小板活性降低，并且血小板聚集變得不穩定，運用特異性的PI3Kβ抑制劑顯示，在不增加出血時間的同時，可防止大鼠和兔動脈血栓的形成，從而證明了PI3Kβ在ADP誘導的血小板活化中發揮著重要作用[9]。在凝血惡烷A2(TXA2)誘導的血小板活化中，可以檢測到PI3Kβ的代謝物和PIP3，并且運用PI3Kβ特異性抑制劑可抑制血小板的聚集，證明PI3Kβ在TXA2誘導的血小板活化信號通路中也起到了重要的作用[10]。

1.2PI3Kβ促進血小板黏附和聚集 誘導血小板活化的信號途徑最終都會激活血小板整合素αⅡbβ3。αⅡbβ3是血小板上的一種黏附受體，其主要作用是上調血小板-血管壁和血小板-血小板之間的黏附作用、促進血小板聚集，因此，血栓的形成主要依賴于整合素αⅡbβ3黏附的信號途徑的啟動。PI3Kβ選擇性抑制劑能夠抑制整合素αⅡbβ3的黏附接觸，從而抑制血栓的形成，限制PI3Kβ的表達后，降低了血小板-血小板之間的接觸作用，并且初始的血栓形成也得到了延遲[11]。有研究報道利用PI3Kβ缺陷的老鼠模型，證明了PI3Kβ能增強αⅡbβ3鍵的親和力，在PI3Kβ缺陷的血小板中，纖維蛋白凝塊的聚集得以延遲，這些血小板幾乎不能黏附于纖維蛋白原上，說明PI3Kβ有促進αⅡbβ3激活的作用，進而促進了血小板的黏附和聚集[12]。

2 PI3Kβ參與血栓形成的信號途徑

PI3Kβ參與了多種促進血栓形成的信號途徑，主要有P2Y12受體、凝血酶受體和GPVI介導的血小板活化的信號傳導。研究PI3Kβ在這些信號途徑中的作用，有利于理解PI3Kβ作為抗血栓治療靶標的機制，也為PI3Kβ作為一種新型抗血栓治療靶標的研究奠定了理論基礎。

2.1PI3Kβ參與P2Y12介導的信號通路 P2Y12是血小板表達的Gi蛋白偶聯的嘌呤受體，ADP是一種生理激動劑，它能夠通過與P2Y12結合而發揮相關的生理作用，ADP激發的血小板效應主要通過P2Y12受體的相關信號通路來完成，P2Y12受體激活后可導致一系列的細胞內事件：鈣離子(Ca2+)的移動,調控顆粒的釋放,TXA2的產生,整合素αⅡbβ3的激活,血小板聚集的信號放大并穩定血小板聚集。剪切力誘導血小板活化，需要GPIb和整合素αⅡbβ3信號功能的相互作用并配合P2Y12受體被激活后逐漸放大的信號，當ADP與P2Y12結合后，會激活PI3Kβ，促使其參與Gi蛋白依賴的信號處理過程，PI3Kβ激活后能進一步誘導Rap1b蛋白的激活，Rap1b是Ras家族的一種GTP酶，它在調節整合素的黏附功能上有明確的作用，進而維持了整合素αⅡbβ3的激活狀態和血小板的穩定聚集[13]。

2.2PI3Kβ參與PAR1和PAR4介導的信號通路 凝血酶是一種主要的血小板激活劑，能夠通過一些受體放大信號而激活血小板，它還能夠使纖維蛋白原轉變為纖維蛋白，在凝血級聯放大反應中有著重要的作用。PAR1和PAR4是血小板表面通過蛋白質水解而激活的兩種凝血酶受體，與Gq蛋白偶聯，當外部蛋白質的N端序列水解后，新暴露的N端能夠作為配體來發揮受體的功能。PAR激活后，能夠通過磷脂酶Cβ(PLCβ)將PI(4,5)P2水解并產生第二信使肌醇-3-磷酸和甘油二酯(DAG)，其中肌醇-3-磷酸能導致鈣離子從胞內釋放，而DAG會激活蛋白激酶C(PKC)，并且PAR1和PAR4還能通過釋放ADP而激活P2Y12受體，通過以上系列事件導致整合素αⅡbβ3激活并促進血栓的形成[14]。PI3Kβ參與了PAR1依賴的信號通路，PI3Kβ被激活后會產生PIP3，PIP3可以促進PLCβ產生第二信使，并通過PKB/Akt磷酸化作用來實現其激活整合素αⅡbβ3的功能，而PI3Kβ和PAR4在維持凝血酶所誘導的整合素αⅡbβ3激活和血小板聚集的過程中屬平行關系[15]。

2.3PI3Kβ參與GPVI介導的信號通路 現在普遍認為vWf和膠原蛋白在血管凝塊的啟動中起著重要作用，當血小板表面的受體GPIb-Ⅸ-Ⅴ和GPⅥ分別與vWf和膠原蛋白相互作用引發血小板的聚集，最近的研究表明，GPⅥ受體在促進血小板黏附和血栓形成過程中占有主導地位。GPⅥ是免疫球蛋白超家族成員，與免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)--FcRγ鏈非共價結合，FcRγ鏈的酪氨酸被磷酸化并觸發一系列的下游信號事件：產生PIP3，使細胞質Ca2+移動，激活整合素αⅡbβ3，分泌裝載著ADP和ATP的血小板顆粒，血小板表面的磷脂酰絲氨酸(PS)負電荷暴露以確保凝血[16]。PI3Kβ參與了整個PIP3形成和Ca2+信號產生的過程，暗示著PI3Kβ在激活PLCγ2的過程中也是必要的酶，通過激活PLCγ2而完成GPⅥ相關的信號通路，PI3Kβ缺陷會抑制Ca2+的增加和PS的暴露，從而減少了血小板的聚集。

3 以PI3Kβ為靶標治療血栓的潛在藥物

近年來許多科研機構和制藥企業致力于研發PI3K抑制劑，但是在臨床上PI3Kβ的特異性抑制劑仍然匱乏。目前，設計與開發PI3Kβ特異性抑制劑的常用方法有：應用X射線、分子對接、分子動力學模擬、化學探針等技術對已有的PI3K抑制劑進行結構分析，并對其結構進行改造和優化，開發出PI3Kβ特異性抑制劑。例如，Kim等[17]通過對氨基嘧啶的分子結構進行改造，在磺酰胺基上結合一個苯環或者將磺酰胺基上的苯基用萘基取代后，得到了一種選擇性和效能更強的PI3Kβ抑制劑，氨基嘧啶的衍生物對PI3Kβ的選擇性和抑制性更強。

3.1PI3Kβ非特異性抑制劑 PI3Kβ非特異性抑制劑主要有：LY294002、PI-103、NVP-BEZ235、渥曼青霉素等。LY294002和渥曼青霉素是最早研發出的PI3K抑制劑，LY294002是經黃酮類化合物的結構改造合成獲得的，它是一種ATP競爭性的非選擇性PI3K抑制劑，可以透過血小板細胞抑制PI3K/Akt信號途徑，但其對PI3K亞型的選擇性較差，抑制效力較低，藥動學性質也較差。渥曼青霉素是從真菌代謝產物中提取得到的，通過抑制普列克底物蛋白的磷酸化來抑制血小板的激活和聚集，渥曼青霉素能抑制血小板5-羥色胺的釋放，其抑制普列克底物蛋白的機制與5-羥色胺類似。PI-103通過抑制細胞生長以及誘導G1期的細胞周期阻滯，抑制了人腫瘤細胞的PI3K/Akt激活[18]。NVP-BEZ235是咪唑喹啉酮的衍生物[4-5]，它是一種雙激酶抑制劑，能同時靶向PI3K和mTOR通路，通過競爭性結合ATP而影響PI3K/Akt/mTOR信號通路下游相關分子的表達水平[19]。

3.2PI3Kβ特異性抑制劑 經典的PI3Kβ特異性抑制劑主要有AZD6482和TGX221，都有抗血栓的功能，并且已進入臨床Ⅰ期試驗。AZD6482是一種強效、強選擇性的PI3Kβ抑制劑，它通過與ATP競爭性地結合相應位點，選擇性地抑制PI3Kβ，它對PI3Kβ的抑制性比對PI3Kδ、PI3Kα和PI3Kγ分別強8、87和109倍。在動物實驗中，AZD-6482表現出非常強的抗血栓作用，且未引起出血和出血時間的延長，對健康志愿者的實驗表明，AZD-6482同樣具有很好的抗血小板聚集作用以及很短的出血時間[20]。TGX221可以抑制由2MeS-ADP誘導的血小板凝聚，血栓烷A2的生成，Akt和胞外信號調節激酶的磷酸化[21]。近年來也涌現出了一些新型的PI3Kβ特異性抑制劑，如KIN-193、AZD8186、SAR260301、MIPS-9922等，這些抑制劑都表現出了對PI3Kβ異構體較高的選擇性，其中MIPS-9922能有效地抑制ADP誘導的血小板聚集，并且在高血流剪切力下抑制了血小板整合素αⅡbβ的活性，在不延長出血時間的前提下抑制了血小板聚集[5]。

3.3具有PI3K靶向的天然化合物 許多天然化合物也具有作為PI3Kβ抑制劑的潛在價值，并且天然物質具備毒副作用小，多靶點等優勢。研究表明，丹酚酸A、蘿卜硫素、山柰酚等一些從天然物質中提取的化合物對PI3K途徑都有明顯有效的抑制作用。丹酚酸A是丹參的水溶性有效成分，研究表明，丹酚酸A抑制了血小板Akt的磷酸化，將丹酚酸A和PI3K抑制劑LY294002、TGX-221進行對比試驗，證明了丹酚酸A的作用靶點是PI3K[22]。蘿卜硫素是從西蘭花、芥藍等十字花科植物中提取出的活性成分，有研究發現蘿卜硫素選擇性地抑制了PI3K/Akt信號途徑，蘿卜硫素雖然不能直接抑制PI3K的催化活性，但是它能使PI3K的調控亞基蛋白泛素化，阻止PI3K遷移至細胞膜，從而抑制PI3K/Akt信號途徑，山柰酚可以很大程度地減弱凝血酶刺激的PI3K/Akt磷酸化，而且在3種血栓動物模型和印跡控制區老鼠中，山柰酚也體現出其很好地抗血栓效果[23]。

4 展 望

PI3Kβ激活血小板可以依賴于多種信號通路，對于這些信號通路的研究，能闡釋其在血栓形成過程中的作用和機制，為PI3Kβ作為一種新型的抗血栓治療靶標奠定了理論基礎。但PI3Kβ響應動脈剪切力信號而激活血小板的機制還存在諸多問題有待探索：P2Y12/Gi信號通路與其他血小板激動劑所激活的信號通路協同作用激活PI3Kβ的機制仍不清楚；異源三聚體G蛋白和酪氨酸激酶協同激活PI3Kβ的機制也有待進一步研究；PI3Kβ激活整合素αⅡbβ的機制尚不清晰，有可能是通過酪氨酸激酶和P2Y12/Gi兩條信號途徑的相互作用。因此，闡釋清楚PI3Kβ的激活機制以及PI3Kβ在血小板激活和血栓形成過程中的作用機制仍需眾多基礎研究。初步的研究表明，PI3Kβ對其他細胞的增殖和生存沒有太大的影響，但PI3Kβ在其他細胞中的功能和重要性還需進一步研究，以確保抑制PI3Kβ的藥物不會對正常細胞的正常生理功能產生負面影響。設計和開發以PI3Kβ為靶點的特異性抑制劑可以通過以下幾種途徑：(1)基于PI3Kβ的結構和每部分結構域的功能設計特異性抑制劑；(2)研究已知的PI3K抑制劑針對PI3Kβ異構體的特異性，并根據PI3Kβ與抑制劑結合的活性部位的結構對這些PI3K抑制劑的結構進行改造和優化；(3)研究已知的廣譜蛋白酶抑制劑(如槲皮黃酮、楊梅酮星形孢菌素等)與PI3Kβ的活性部位的結合情況，并確定每種抑制劑的半數抑制濃度，從而篩選出有特異性強的PI3Kβ抑制劑，設計或者篩選出抑制PI3Kβ的化合物后，再進一步對這種化合物進行研究、改進和臨床研究。PI3Kβ作為一種響應動脈剪切力從而誘導血小板活化的酶，是一種有潛力抗血栓治療的理想靶標。將PI3Kβ作為靶標的藥物和治療方法能夠實現在不影響正常止血的前提下，選擇性地抑制高剪切力所誘導的病理性血栓的形成，所以，基于PI3Kβ的抗血栓藥物的研究有著巨大的潛在價值。

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重慶市科委基礎與前沿基金資助項目(cstc2014jcyjA10125)；重慶市高等教育教學改革研究重點基金資助項目(142083)；重慶醫藥高等專科學校科研計劃基金資助項目(ygz2015107)。

唐倩(1979-)，副教授，碩士，主要從事新藥研發及質量分析研究。△

，E-mail：alicexu0410@126.com。

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1671-8348(2017)28-4000-04

2017-04-21

2017-06-19)