銅離子對N2a細胞生長分化的影響

陳濤+林寅+雷正波+張安鐸+吳亮+陽小飛+陳恒玲

摘要：在小鼠的神經(jīng)母瘤細胞（N2a細胞）中觀察了銅離子對細胞生長分化的影響。在N2a細胞生長發(fā)育的過程中，于培養(yǎng)基中加入不同濃度的銅離子，對細胞進行了成像。采集不同生長時期的細胞分化率、分支數(shù)和分支長三個指標進行了測算、分析。結(jié)果表明：在N2a細胞加入梯度濃度的銅離子后，除在加入24 h對細胞的分支長略有抑制作用外，銅離子對神經(jīng)細胞的生長和分化并無顯著影響。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)細胞分化；銅離子； 突觸形成； N2a細胞

1 引言

作為生物體最復(fù)雜的系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)負責(zé)生物體各種信息的傳遞。神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞通過神經(jīng)突觸釋放神經(jīng)遞質(zhì)而實現(xiàn)。研究突觸的形成和調(diào)節(jié)機制，是理解神經(jīng)系統(tǒng)各種工作機制的基礎(chǔ)。研究學(xué)習(xí)、記憶的過程，其實就是研究學(xué)習(xí)、記憶中相關(guān)神經(jīng)突觸形成和調(diào)節(jié)的過程[1～3]。重大神經(jīng)退行性疾病如老年癡呆癥、帕金森綜合癥等疾病也已被證明與神經(jīng)突觸的非正常損傷、退化密切相關(guān)，研究突觸的形成和調(diào)節(jié)機制，是治療這些疾病的前提和依據(jù)[4～7]。

銅是細胞生長的一種必須的微量元素，它以輔基的形式參與細胞內(nèi)的多種代謝途徑。細胞內(nèi)銅離子的變化具有廣泛的影響，細胞內(nèi)銅離子的濃度過低會影響細胞內(nèi)一些酶的活性及相應(yīng)的生理代謝途徑進而影響細胞的正常功能和存活。據(jù)相關(guān)研究顯示，成年人體內(nèi)銅離子總量約為100～150 mg，嬰幼兒每天銅攝入量約為0.4～1.0 mg，成年人每天銅攝入量約為1.5～3 mg，血清銅的正常值約10～20 μmol/L，在腦脊液中濃度更低。雖然是生理上必須的金屬離子，但當銅離子的濃度超過生理需求時亦會引起嚴重的問題[8～10]。

為了探索銅離子對神經(jīng)細胞生長分化的具體影響，實驗選用小鼠的神經(jīng)瘤細胞（N2a細胞）作為實驗對象，在其生長的培養(yǎng)基中加入不同濃度的銅離子，通過對不同生長時期的細胞進行成像，測算細胞分化率、分支數(shù)和分支長并對測算結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除銅離子在較低濃度下對神經(jīng)細胞的生長和分化并無特別顯著的影響，顯示神經(jīng)細胞對低濃度的銅離子具有一定的耐受能力。

2 材料與方法

2.1 材料

實驗所用N2a細胞，均系武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院周嚴實驗室贈送，并于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，約每36～48 h傳代一次。

2.2 實驗儀器與試劑

實驗中細胞培養(yǎng)所用的恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱系由美國Thermo Fisher公司生產(chǎn)，細胞傳代及轉(zhuǎn)染所用的超凈工作臺由蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)，離心機由美國Thermo Fisher公司生產(chǎn)，恒溫水浴鍋由鞏義市予華儀器有限公司生產(chǎn)，渦旋振蕩器由其林貝爾儀器制造有限公司，免疫熒光共聚焦顯微鏡（Nikon Texas eclipse Ti）由日本尼康株式會社生產(chǎn)。

實驗所需生化試劑均由美國Gibco公司生產(chǎn)，所有無機試劑均由美國Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)。

2.3 方法

2.3.1 實驗溶液配制

利用胎牛血清、DMEM等試劑配制實驗所需的細胞培養(yǎng)基及相關(guān)緩沖液。所有溶液均需調(diào)整pH值及滲透壓至適宜細胞生長和實驗進行的值，并除菌。配置四個濃度梯度的氯化銅溶液，使銅離子工作濃度分別為0.0002 mg/mL、0.001 mg/mL、0.005 mg/mL、0.02 mg/mL。

2.3.2 細胞傳代，準備生長密度合適的N2a細胞

以T25培養(yǎng)瓶為容器對細胞進行培養(yǎng)，以80%的覆蓋率作為細胞是否傳代的臨界點，當細胞的覆蓋率大于80%時對細胞進行傳代。傳代時，先清除培養(yǎng)基，之后取2 mL PBS緩沖液輕柔地對細胞進行清洗，以清洗細胞生長過程中的各種分泌物和殘留的培養(yǎng)基，上述工作重復(fù)2次。之后加入1 mL 0.05%的胰蛋白酶-EDTA溶液，放入二氧化碳培養(yǎng)箱消化約2 min，當輕搖培養(yǎng)瓶可見細胞從培養(yǎng)瓶壁上滑落即可停止消化。加入3倍體積的細胞培養(yǎng)基終止消化，并輕輕將尚未從培養(yǎng)瓶壁上脫落的細胞吹打下來。將上述細胞懸濁液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，以300～400 g離心2 min。去除離心后的上清液后加入新的培養(yǎng)基輕柔地將細胞重懸，按比例種植到6孔板中，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3.3 加入不同濃度的銅離子溶液并經(jīng)行細胞成像

在移植約12 h后，細胞密度基本保持50%～80%，分別在6孔板中設(shè)置空白對照組，0.0002 mg/mL、0.001 mg/mL、0.005 mg/mL、0.02 mg/mL四個濃度梯度的銅離子加藥組，及兩個備用組。分別在加入不同濃度梯度銅離子后的24 h、48 h對神經(jīng)細胞進行成像。

2.3.4 數(shù)據(jù)的采集與處理

統(tǒng)計各組神經(jīng)細胞的分化率和分支長，利用Image J （National Institutes of Health）采集神經(jīng)細胞的分支長，將突起總長度大于細胞胞體直徑2倍的細胞視作分化細胞。以上所得數(shù)據(jù)以隨機區(qū)組設(shè)計方式，用SPSS Statistic 23 （IBM Corporation）進行t檢驗，利用GraphPad Prism 6 （GraphPad Software， Inc）及Adobe Illustrator CC （Adobe Corporation）進行統(tǒng)計圖繪制。

3 結(jié)果

3.1 加入Cu2+24 h后對N2a細胞生長分化的影響

根據(jù)有關(guān)文獻報道，Cu2+是人體所需的元素之一，但當其含量過高亦會產(chǎn)生不良影響。為探究Cu2+對神經(jīng)細胞生長分化的影響，選取N2a細胞作為研究對象，培養(yǎng)約12 h后使細胞密度基本保持50%～80%，加入Cu2+濃度分別為0.0002 mg/mL、0.001 mg/mL、0.005 mg/mL、0.02 mg/mL的CuCl2溶液。分別在培養(yǎng)24 h后對細胞進行成像，采集細胞的分化率和分支數(shù)，并以Image J軟件測量細胞的分支長，依照隨機區(qū)組方式進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，在對三次獨立重復(fù)實驗進行了統(tǒng)計學(xué)分析（圖1）。

在N2a細胞生長的培養(yǎng)基中加入梯度濃度的CuCl2溶液，培養(yǎng)24 h后對細胞成像發(fā)現(xiàn)，濃度為0.02 mg/mL 的Cu2+使細胞的分支長略有減少。除此之外，梯度濃度的Cu2+對神經(jīng)細胞的生長和分化并未產(chǎn)生顯著影響。0.02 mg/mL的Cu2+濃度已經(jīng)遠超過血清中正常的Cu2+濃度，因此過高濃度的Cu2+對神經(jīng)細胞的分化呈抑制作用。

3.2 加入Cu2+48 h后對N2a細胞生長分化的影響

高濃度的Cu2+作用于神經(jīng)細胞24 h即對分化產(chǎn)生一定的抑制作用，為繼續(xù)研究更長時間的Cu2+作用對神經(jīng)細胞的影響，加入Cu2+濃度分別為0.0002 mg/mL、0.001 mg/mL、0.005 mg/mL、0.02 mg/mL的CuCl2溶液48 h后，分別對細胞進行成像，采集細胞的分化率和分支數(shù)，并以Image J軟件測量細胞的分支長，依照隨機區(qū)組方式進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，再對三次獨立重復(fù)實驗進行了統(tǒng)計學(xué)分析（圖2）。

在N2a細胞生長的培養(yǎng)基中加入梯度濃度的CuCl2溶液，培養(yǎng)48 h后對細胞成像發(fā)現(xiàn)，梯度濃度的Cu2+對神經(jīng)細胞的分化率、分支數(shù)和分支長均無顯著影響。這一結(jié)果說明Cu2+雖然對神經(jīng)細胞的分化有一定的抑制作用，但這個作用主要存在于分化的早期，隨著分化時間的延長，神經(jīng)細胞仍能達到正常的分化水平。

4 討論

作為神經(jīng)系統(tǒng)實現(xiàn)功能的重要事件，神經(jīng)細胞分化是受眾多因素影響的復(fù)雜過程，同時也是神經(jīng)科學(xué)需要研究和闡明的重要問題。細胞內(nèi)的多種代謝途徑中，銅離子以輔基的形式存在其中，其濃度可以影響正常生理功能的維持。銅離子是人體所必須的金屬離子之一，此次研究重點探討了銅離子對神經(jīng)細胞分化的影響。

研究選擇N2a細胞作為實驗材料。N2a細胞，即mouse neuroblastoma N2a cells，別名Neuro-2a，是由Klebe和Ruddle經(jīng)A株白鼠的自生腫瘤建立，該細胞貼壁良好，多數(shù)成神經(jīng)元樣，具有軸突樣結(jié)構(gòu)。N2a細胞常見易得，且易于培養(yǎng)，在神經(jīng)細胞的分化神經(jīng)信號通路的研究中已被大量應(yīng)用[11，12]。

通過在N2a細胞生長的培養(yǎng)基中加入梯度濃度的Cu2+離子，通過采集神經(jīng)細胞分化率、分支數(shù)和分支長3個指標的數(shù)據(jù)，來研究不同濃度的Cu2+離子對神經(jīng)細胞分化的影響。對所采集到的數(shù)據(jù)進行通風(fēng)機學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，除在高濃度Cu2+離子（0.02 mg/mL）在加入初期（24 h）對神經(jīng)細胞的分支長略有抑制作用外，不同梯度濃度的Cu2+離子對于神經(jīng)細胞的生長和分化均無顯著的影響。根據(jù)實驗結(jié)果推測，神經(jīng)細胞對Cu2+離子具有一定的耐受能力，在相對較低的濃度下，Cu2+離子不會影響神經(jīng)細胞的生長和分化。但是過高濃度的Cu2+會降低細胞分化初期的分化能力。

參考文獻：

[1]Viola H， Ballarini F， Martínez M C， et al. The tagging and capture hypothesis from synapse to memory[J]. Prog Mol Biol Transl Sci， 2014（13）：391～423.

[2]Caroni P， Chowdhury A， Lahr M. Synapse rearrangements upon learning： from divergent-sparse connectivity to dedicated sub-circuits[J]. Trends Neurosci， 2014， 37（10）：604～614.

[3]Kastellakis G， Cai D J， Mednick S C， et al. Synaptic clustering within dendrites： an emerging theory of memory formation[J]. Prog Neurobiol， 2015（6）：19～35.

[4]Cao X， Tabuchi K. Functions of synapse adhesion molecules neurexin/neuroligins and neurodevelopmental disorders[J]. Neurosci Res， 2016（16）： 30141～30149.

[5]Neuman K M， Molina-Campos E， Musial T F， et al. Evidence for Alzheimers disease-linked synapse loss and compensation in mouse and human hippocampal CA1 pyramidal neurons[J]. Brain StructFunct， 2015（6）：3143～3165.

[6]Leshchynska I， Liew H T， Shepherd C， et al. Aβ-dependent reduction of NCAM2-mediated synaptic adhesion contributes to synapse loss in Alzheimers disease[J]. Nat Commun， （6）：8836.

[7]Pienaar I S， Burn D， Morris C， et al. Synaptic protein alterations in Parkinsons disease[J]. MolNeurobiol， 2012，45（1）：126～143.

[8]Grasso G， Pietropaolo A， Spoto G， et al.Copper（I） and copper（II） inhibit Aβ peptides proteolysis by insulin-degrading enzyme differently： implications for metallostasis alteration in Alzheimers disease[J].Chemistry， 2011，17（9）：2752～2762.

[9]DellAcqua S， Pirota V， Anzani C， et al.Reactivity of copper-α-synuclein peptide complexes relevant to Parkinsons disease[J].Metallomics， 2015，7（7）：1091～1102.

[10]Tisato F， Marzano C， Porchia M， et al.Copper in diseases and treatments， and copper-based anticancer strategies[J].Med Res Rev， 2010，30（4）：708～749.

[11]Zeng M， Zhou J. Roles of autophagy and mTOR signaling in neuronal differentiation of mouse neuroblastoma cells[J]. Cellular Signalling， 2008， 20（4）： 659～665.

[12]Gutie rrez-Martín Y， Bustillo D， Go？ mez-Villafuertes R， et al. P2X7 Receptors Trigger ATP Exocytosis and Modify Secretory Vesicle Dynamics in Neuroblastoma Cells[J]. Journal of biological chemistry， 2011， 286（13）： 11370～11381.

Influence of Copper Ionon N2a Cells Growth and Differentiation

Chen Tao，Lin Yin， Lei Zhengbo，Zhang Anduo，Wu Liang，Yang Xiaofei， Chen Hengling

（Key Laboratory of Cognitive Science， Key Laboratory of Medical Information Analysis and

Tumor Diagnosis and Treatment， Laboratory of Membrane Ion Channels and Medicine，

College of Biomedical Engineering， South-Central University for Nationalities， Wuhan，Hubei 430074， China）

Abstract： To investigate the influence of copper ion on the growth and differentiation in the mouses Neuroblastoma （N2a） cells， we addeddifferent concentrations of copper ion in the growth medium ofN2a cells. After calculating differentiation ratio， branches number and length of branches of N2a cells fromthe images of treated cells， Results show that different concentrations of copper ion had no significant effect on the growth and differentiation of N2a Cells， which expected a slightinhibition effect on length of branches after 24-hour treatment.

Key words： nerve cell differentiation；copper ion；synapse formation； N2a cells