牛場肥水灌溉冬小麥對不同土層中氨氧化細菌群落多樣性的影響

崔丹瑤，孫 溪，高文萱

(1.農業部環境保護科研監測所，天津 300191；2.天津農學院 食品科學與生物工程學院，天津 300384；3. 天津市農副產品深加工技術工程中心，天津 300384)

施肥是對作物管理最具有影響力的方式之一[1]，土壤中不同群類微生物，如氨氧化細菌(Ammonia-oxidizing bacteria，AOB )，均受到不同施肥制度的影響[2]。氨氧化細菌作為土壤硝化作用的主要驅動者[3,4]，通過控制氨單加氧酶(amoA)的活性來影響硝化作用的亞硝化過程[5]，該過程是硝化作用的限速步驟[6]。硝化作用是土壤氮素循環的主要方式，也是氮素流失的潛在途徑之一[7]，所以研究施肥對氨氧化細菌的影響是土壤微生物生態學的重要組成部分，氨氧化細菌也被稱為土壤生態學的模式生物[8]。研究不同施肥條件下，土壤中氨氧化細菌群落結構多樣性對于檢測土地質量及作物的生產水平是極為重要的。

由于土壤中99%的微生物無法在實驗室中培養[9]，所以學者們越來越熱衷于通過分子生物學的方法來研究土壤中微生物的群落多樣性。1997年Rotthauwe等[10]用PCR法擴增amoA基因,對氨氧化細菌的群落結構進行了研究。2012年，王亞男等[11]通過對amoA基因TRFLP-PCR與qPCR技術相結合的方法，研究了不同處理下AOB的群落組成和豐度的變化，得出了施肥類型和土壤層次均是影響AOB群落豐度和結構組成的重要因素的結論。2015年，周志成等[12]通過建立amoA克隆文庫，研究在紅壤蔬菜田上施加無機肥與有機肥等AOB和AOA的多樣性，結論為有機肥比無機肥提高了AOB與AOA的多樣性。

牛場肥水中含有大量的氮素資源[13]，而這些氮素資源常常得不到再循環利用，而是被排放到地下水中，造成水資源污染。而近些年，中國農業用水已占全國總用水量的60%[14]，那么將牛場肥水作為灌溉水，循環利用于作物土壤中，既不造成污染，又解決了用水問題，這是人們一直所期待的[15]。目前研究施肥制度對土壤中微生物群落多樣性的影響主要是針對施肥種類(包括無機肥，有機肥，無機肥與有機肥配施等)[16-18]，而針對作物不同生長期，進行次數控制的施肥對于讓微生物的影響則研究較少。而且，大部分對于AOB群落多樣性的研究多為表層土(0～5 cm或0～20 cm)[19-20]，研究20～40 cm土層的則比較少。本文研究了牛場肥水灌溉對于0～20 cm土層與20～40 cm土層的AOB群落多樣性，為肥水灌溉的科學管理提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

本試驗中采集土壤樣品的地點位于河北省徐水縣梁家營施肥田(38°09-39°09N，115°19-115°46E)，該地處于太行山東麓，河北省中部，屬大陸性季風氣候。

1.2 試驗材料處理

試驗共設置8個處理，每個處理設置3組平行，分別為各生長期均用清水灌溉的CK組；播種后、拔節期為無機肥處理的CF組；其余6組編為T1～T6，為不同時期，不同濃度的牛場肥水灌溉處理，各個處理施肥量詳情見表1。

試驗小區長9 m寬6 m，中間有1 m保護行。作物的種植方式為冬小麥與夏玉米交替種植，試驗中的小麥品種為濟麥22，玉米品種為農大221，牛場肥水的沼液原液成分見表2。

表1 各處理中的施肥量Tab.1 Fertilizer amount in different treatment

表2 肥水沼液原液成分Tab.2 The composition of cattle biogas slurry

1.3 樣品采集

樣品采集的時間為小麥收割后的6月中旬，采用“五點法”進行樣品采集，每個小區隨機采集0～20 cm與20～40 cm兩個土層的土樣，去除雜草、秸稈、碎石等，將同一土層的5個土樣混合，裝入密閉塑封袋中，暫時在冰盒中保存，后存放于-20 ℃冰箱中。

1.4 土壤總DNA提取

采用FastDNA? SPIN Kit For Soil試劑盒提取土壤中DNA基因組，具體實驗步驟參照說明書進行。使用Nano Drop核酸蛋白儀對DNA的濃度進行測定，根據測定結果對DNA進行稀釋，存放于-20 ℃冰箱，供后續試驗使用。

1.5 PCR擴增及酶切分析

PCR擴增的引物與反應條件如表3所示。PCR產物經純化回收后，使用MSP I(TAKARA)進行酶切反應[21]，體系參考說明書。將酶切產物送往生物公司進行檢測。

表3 PCR反應條件Tab.3 PCR reaction condition

注：①上下游引物分別標注為F和R; ②S=Cor G; W=Aor T; ③用6-FAM對上游引物進行熒光標記。

1.6 克隆及測序分析

將1.5中的純化產物與T載體連接，并將其轉化到大腸桿菌感受態細胞(DH5α)中，進行藍白斑篩選，將篩選得到的100個經菌落PCR驗證的陽性克隆子送往生物公司測序。

1.7 數據處理

結合T-RFLP數據，計算0～20 cm與20～40 cm兩個土層中氨氧化細菌的多樣性指數，并用CANOCO for Windows 4.5 軟件進行主成分(PCA)分析。用MEGA 6.0構建兩個土層的amoA基因系統發育樹，統計學分析采用SPSS 17.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 施肥對0～20 cm土層氨氧化細菌的影響

2.1.1 不同施肥處理下氨氧化細菌群落結構的變化

將MSP I酶切amoA基因的T-RFLP結果進行總結，如圖1可見，共有16種片段，但56 bp、66 bp、156 bp、235 bp、256 bp在所有片段中所占百分比比例較高，占主導地位，為優勢菌群。

圖1 0～20cm土層不同處理氨氧化細菌(AOB)T-RFs 相對豐度百分比
Fig.1 0～20 cm layer relative abundance of AOB amoA T-RFs in different fertilization treatments

對0～20 cm土層的T-RFs進行主成分分析(PCA)，結果如圖2所示，主成分1(PC1)解釋了77.2%的物種變量，主成分2(PC2)解釋了13.2%的物種變量。除T1之外的牛場肥水灌溉處理(T2、T3、T4、T5、T6)均在PC1的負軸，而清水處理(CK)和無機肥處理(CF)均在PC1的正軸，且明顯分開。除T1處理之外，牛場肥水灌溉降低了主要成分所占的比例，無機肥處理提高了主要成分比例，不同牛場肥水處理之間對群落結構的影響并不明顯。

對0～20 cm土層氨氧化細菌的主成分2(PC2)進行分析，與無機肥處理(CF)相比，清水灌溉處理(CK)對次要成分的影響最大；T1、T6、T3、T4這四個處理在PC2上相差不大，說明CF處理增加了氨氧化細菌的次要種類，而不同牛場肥水灌溉對其無明顯影響。

圖2 0～20 cm土層氨氧化細菌主成分(PCA)分析Fig.2 0～20 cm layer AOB principal component analysis(PCA)

2.1.2 不同施肥處理對氨氧化細菌群落多樣性的影響

根據表4所示，Shannon-Weiner(H)、Simpson(D)、Pielou(E)指數中，T1處理均為最大值，說明T1處理在一定程度上增加了0～20 cm土層中氨氧化細菌的多樣性和豐富度，且效果顯著；T4處理均為最小值，說明T4處理在一定程度上降低了0～20 cm土層中氨氧化細菌的多樣性，T5與CK相比，能增加土壤中AOB的種群多樣性但效果不明顯。

表4 0～20 cm土層各處理的多樣性指數統計表Tab.4 0～20 cm layer diversity index in different treatment

注：不同英文字母表示P<0.05 水平差異顯著性。

2.1.3 氨氧化細菌系統發育樹的構建

對于0～20 cm土層的氨氧化細菌克隆文庫，共挑取了107個經PCR驗證后的陽性克隆子。經BLAST比對后，按酶切片段進行分型，得到18個典型的操作分類單元(OTU)，構建系統發育樹。

參考先前文獻中被廣泛認可的命名方式，對氨氧化細菌的系統發育樹進行命名[22]。從圖3可知，多數序列屬于β-變形菌門，主要包括亞硝化螺菌屬(Nitrosospira) cluster 3a、3b、cluster 2及亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas) cluster 6。結合表5可以看出屬于Nitrosospira cluster3a的片段包括156和256bp，屬于Nitrosospira cluster 3b的片段包括60 bp，235 bp，Nitrosospira cluster 2的片段包括50 bp與60 bp，Nitrosomonas cluster 6的片段包括56 bp與235 bp。根據表5顯示，60 bp與235 bp所占的比例較多。Nitrosospira屬的氨氧化細菌所占比例約為95%，為主要菌群。Nitrosomonas類群所占比例約為5%。

圖3 0～20 cm土層amoA序列的氨氧化細菌系統發育樹Fig.3 Tree of ammonia oxidizing bacteria based on analysis of 0～20 cm amoA sequences

T-RFsOTUs代表的克隆子數克隆子所占比例/%登錄號近緣種相似性/%50OTU111.041HQ638970.1unculturedammonia-oxidizingbacterium10056OTU211.041KT001130.1unculturedbacterium10060OTU322.083EU624876.1unculturedammonia-oxidizingbacterium99OTU422.083KP781201.1unculturedammonia-oxidizingbacterium100OTU511.041KP783327.1unculturedbetaproteobacterium97OTU63637.5HQ875335.1unculturedammonia-oxidizingbacterium100OTU755.208KM520895.1unculturedbetaproteobacterium100OTU81313.541KP781219.1unculturedammonia-oxidizingbacterium99156OTU911.041KT768084.1unculturedammonia-oxidizingbacterium100OTU1011.041KT768084.1unculturedammonia-oxidizingbacterium100OTU1122.083KM520900.1unculturedbetaproteobacterium100OTU1288.333KR081225.1unculturedammonia-oxidizingbacterium100

續表5 0～20cm土層氨氧化細菌的T-RFLP 與 OTUs 序列的模擬酶切比對結果

2.2 施肥對20～40 cm 氨氧化細菌的影響

2.2.1 不同施肥處理下氨氧化細菌群落結構的變化

同樣使用限制性內切酶MSP I進行酶切，將T-RFLP結果總結，如圖4所示，共有14種片段。其中有4個主要片段：56、66、156、235 bp，為20～40 cm土層中AOB的優勢菌群。不同施肥處理間，氨氧化細菌優勢菌群的差異不明顯，與0～20 cm土層中的情況相同，56 bp代表的氨氧化細菌是最具有優勢的種群。

圖4 20～40 cm土層不同處理氨氧化細菌(AOB)T-RFs 相對豐度百分比
Fig.4 20～40 cm relative abundance of AOB ’ s T-RFs in different treatments

對20～40 cm土層的T-RFLP結果中的T-RFs進行主成分分析(PCA)，如圖5。主成分1(PC1)解釋了38.8%的物種變量，主成分2(PC2)解釋了28.5%的物種變量。T3、T4、T5、T6均在PC1的正軸，CK、CF、T1、T2均在PC1的負軸，說明不同濃度的牛場肥水處理對氨氧化細菌的主要種類的影響是不同的。T5處理在PC2正軸的最遠處，說明高濃度的牛場肥水灌溉會對20～40 cm的次要成分造成明顯影響。CK、CF、T1、T2這4種處理均在PC2的正軸，但距離很近，說明清水處理，無機肥處理，牛場肥水處理都會對氨氧化細菌的次要種類有所增加，但相互之間的差別不明顯。

2.2.2 不同施肥處理對氨氧化細菌群落多樣性的影響

根據T-RFLP數據分析結果，計算出3個關于生物多樣性的指數，如表6。Shannon -Weiner (H)、Simpson (D)、Pielou(E)指數T1處理均為最大，T4、T6均小于CK組，說明T1組的處理明顯增加了20～40 cm土層中AOB的群落多樣性和豐富度，T4和T6在一定程度上降低了AOB的群落多樣性和豐富度，這與0～20 cm土層的情況相一致。

圖5 20～40 cm土層氨氧化細菌主成分(PCA)分析Fig.5 20～40 cm layer AOB principal component analysis(PCA)

處理指數H指數D指數ECK1.593±0.094a0.703±0.036a0.715±0.046aCF1.641±0.094a0.754±0.036a0.807±0.046aT11.76±0.094a0.776±0.036a0.808±0.046aT21.704±0.094a0.762±0.036a0.793±0.046aT31.681±0.094a0.735±0.036a0.761±0.046aT41.524±0.116a0.667±0.045a0.701±0.056aT51.566±0.094a0.705±0.036a0.76±0.046aT61.51±0.094a0.68±0.036a0.683±0.046a

注：不同英文字母表示P<0.05 水平差異顯著性。

為探究0～20 cm土層與20～40 cm土層之間是否具有顯著性差異，選取T1、T4、CK、CF這四個處理，對它們的Shannon-wiener (H) 指數、Simpson (D) 指數Pielou (E) 指數進行橫向比較。根據表7、表8顯示，T1處理與CF處理對于兩個不同土層中AOB的群落多樣性和均勻度具有顯著的影響。說明在T1與CF處理時，不同的土壤深度，其AOB群落多樣性和均勻度也是不同的。

2.2.3 氨氧化細菌系統發育樹的構建

從系統發育樹圖6可知，多數序列屬于β-變形菌門，這與0～20 cm土層情況相同。但在20～40 cm土層，氨氧化細菌主要包括Nitrosospira cluster 3a、3b、4,共3個屬。結合表9進行分析，Nitrosospira cluster 3a中只有156 bp；屬于Nitrosospira cluster 3b的片段有56 bp，66 bp，156 bp，235 bp和256 bp；Ni-trosospira cluster 4的片段為60 bp。與0～20 cm土層情況不同的是，20～40 cm土層中，不存在Nitrosospira cluster 2與Nitrosomonas cluster 6這兩個屬，這說明0～20 cm與20～40 cm土層中的微生物群落是不相同的。

表7 T1、T4、CK、CF Shannon-wiener 指數橫向比較Tab.7 T1、T4、CK、CFtransverse comparisonofShannon-wienerindex

注：不同英文字母表示P<0.05 水平差異顯著性。

表8 T1、T4、CK、CF Pielou 指數橫向比較Tab.8 T1、T4、CK、CF transverse comparison of Pielou index

注：不同英文字母表示P<0.05 水平差異顯著性。

圖6 20～40 cm土層amoA序列的氨氧化細菌系統發育樹Fig.6 Tree of ammonia oxidizing bacteria based on analysis of 20～40 cm amoA sequences

3 討論與結論

本文采用T-RFLP技術，研究了不同施肥制度下，牛場肥水灌溉對0～20 cm土層與20～40 cm土層中AOB的群落結構變化。根據表4顯示：CF的Shannon-wiener(H) 指數大于CK，這說明無機肥處理(CF)比清水灌溉(CK)更能促進土壤中氨氧化細菌的多樣性；T1的H指數大于CF，說明中等濃度的肥水灌溉(T1)處理比無機肥灌溉(CF)能夠更好地促進土壤中氨氧化細菌的群落多樣性；CK、T5、T6這3種處理的H指數差別較小，說明相同時期，相同灌溉次數，高濃度的牛場肥水(T5)或低濃度的牛場肥水(T6)對AOB的多樣性影響與清水灌溉(CK)效果相似。王亞男等[11]發現1/2MNPK(有機肥與無機肥混合)處理的amoA基因拷貝數要大于MNPK，MNPK處理并沒有因為高濃度的氮素而增加土壤中AOB的多樣性，這與本文的發現相一致。

20～40 cm土層中AOB多樣性指數如表6，T1、T2、T3、T4的多樣性指數(H)之間的關系與表層土不同，為T1>T2>T3>T4，這說明在相同的牛場肥水濃度下，施肥次數與AOB群落多樣性之間呈反比例關系，T1處理(105 kg N/hm2，39 kg P2O5/hm2，清水∶沼液=2∶1，1次灌溉)促進了AOB的群落多樣性，T4處理(420 kg N/hm2，156 kg P2O5/hm2，清水∶沼液=2∶1，4次灌溉)抑制了AOB的群落多樣性。這是因為在0～20 cm土層中，土壤中的可用資源較多，群落之間的競爭關系弱，為微生物提供了良好的生存環境，多樣性指數較高。但隨著土層的加深，資源的有限性和環境的同質性使得生態條件不能夠充分滿足土壤微生物的生長需求[23]，于是不同群落之間的競爭關系變強，出現了明顯且穩定的優勢群落。施肥次數的增加會使氮素等成分增加，優勢種群生長旺盛，進而抑制了其他的種群，使AOB的群落多樣性和豐富度降低。這與前人研究發現的不同類型氨氧化細菌對土壤基質與銨離子的敏感度不同，不同的氮素濃度會改變氨氧化細菌的主要種類的結論一致[24-25]。 在施肥方式一定的情況下，0～20 cm土層的多樣性指數(Shannon-wiener指數，Simpson指數，Pielou指數)均比20～40 cm的多樣性指數高。這與前人分析的結果相一致。Griffiths等[26]利用16S rDNA PCR擴增和DGGE的方法檢測了測了0～5，5～10，10～15，15～20 cm，4個土層中細菌群落及多樣性。發現0～5 cm多樣性高，養分被利用得充分，越深的土層多樣性越低。

表9 20～40 cm土層氨氧化細菌的T-RFLP與OTUs序列的模擬酶切比對結果Tab.9 20～40 cm layer ammonia-oxidizing bacteria comparison between T-RFLP patterns and OTUs sequences

根據圖1和圖4顯示，56 bp代表的氨氧化細菌在0～20 cm土層中，各處理的豐度與CK組相比，差異很大；而20～40 cm土層中各組處理的豐度變化則較小。說明56 bp代表的氨氧化細菌能夠更好地適應深層土的環境，充分利用施肥后土壤中的養分，與其他種群競爭，從而成為優勢種群。施肥次數越多，此類氨氧化細菌生長越旺盛，群落總體的多樣性降低，均勻度也降低。

235 bp代表的氨氧化細菌，在0～20 cm土層中，所占豐度變化浮動較小；在20～40 cm土層中，235bp所占百分比依舊穩定，各處理之間變化浮動較小。而且發現兩個土層中清水灌溉(CK)，無機肥(CF)，中等含氮量的肥水(T1)，高含氮量的肥水(T5)之間的豐度差別不大，說明235 bp片段代表的在群落中所占比例相對穩定，推測235 bp代表的氨氧化細菌對銨濃度不敏感。結合0～20 cm系統發育樹，235 bp代表的氨氧化細菌屬于亞硝化螺菌屬(Nitrosospira )cluster 3b和亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)cluster 6，而根據前人的研究顯示，王亞男等[27]證實，Nitrosospira cluster 3 在不同濃度的氮肥處理中均處于優勢種群，推測Nitrosospira cluster 3 屬對銨離子濃度不敏感，與本文研究相符。

根據圖3與圖6的系統發育樹顯示，兩個土層中的AOB均包括Nitrosospira cluster 3a，Nitrosospira cluster 3b這兩個屬，并稱為Nitrosospira cluster 3屬，這說明在長期施肥的條件下，不同土層中，優勢種屬沒有發生改變，且Nitrosospira屬占的比例分別為95%與100%，這與前人研究得出的土壤中氨氧化細菌以亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)為主，而非亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)的結論相一致[28-31]．但在20～40 cm土層中，沒有Nitrosospira cluster 2與Nitrosomonas cluster 6這兩個屬，說明不同的土層在不同程度上改變了氨氧化細菌的群落結構。

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