高效液相色譜法測定環境樣品中稻瘟酰胺殘留

吳文鑄+郭敏+孔德洋

摘要：采用高效液相色譜法，建立了環境樣品中稻瘟酰胺殘留分析方法。用乙酸乙酯萃取環境水樣品；土壤樣品用丙酮提取，乙酸乙酯萃取；魚體樣品用乙腈直接萃取；用高效液相色譜法測定環境樣品中稻瘟酰胺殘留。結果表明，該方法在0.5～10.0 mg/L范圍內線性良好，土壤、水、魚體中稻瘟酰胺的最小檢測濃度分別為0.05、0.01、0.05 mg/kg。空白土壤、水和魚體樣品中的加標回收率為76.5%～101.7%，RSD為0.4%～10.5%。該方法分析速度快、靈敏度高、重現性好，適用于稻瘟酰胺在環境樣品中的快速檢測。

關鍵詞：稻瘟酰胺；高效液相色譜分析；殘留檢測；環境樣品

中圖分類號： X592；TQ450.2+63 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0326-03

稻瘟酰胺（fenoxanil），是由Shell公司研制，經巴斯夫和日本農藥公司共同開發的酰胺類殺菌劑[1-2]，化學名稱為 N-（1-氰基-1，2-二甲基丙基）-2-（2，4-二氯苯氧基）丙酰胺，分子式C15H18Cl2N2O2，相對分子質量為329.22，結構式如下：

原藥為白色粉末，熔點為69.5～71.5 ℃，在pH值=5、7、9時，對酸、堿、熱穩定，易溶于乙酸乙酯、乙腈和丙酮等有機溶劑。稻瘟酰胺具有良好的內吸性，持效期較長，具有治療和抑制孢子形成等作用，可單獨使用也可與保護性殺菌劑混用，是目前防治稻瘟病的最佳藥劑之一[3-5]。

目前針對稻瘟酰胺的檢測方法國內主要集中在氣相色譜法的測定[6-10]，運用液相色譜法[11-12]測定環境樣品中稻瘟酰胺的分析方法鮮有報道。本研究通過優化樣品前處理方法和液相色譜相關條件，測定土壤、水和魚體等環境樣品中稻瘟酰胺殘留，為深入評價稻瘟酰胺的安全合理使用及環境監測提供相應的科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：WATERS 2695/2998液相色譜儀，PDA檢測器（WATERS，美國）；Excella E24R全溫度振蕩器（New Brunsuick Scientific，美國）；CR 22GⅡ離心機（HITACHI，日本）；Rotavapor R-210旋轉蒸發儀（BUCHI，瑞士）；MG-2200 氮吹儀（EYELA，日本）。

試劑與材料：乙酸乙酯、丙酮、乙腈、氯化鈉、無水硫酸鈉、磷酸等，均為分析純（南京化學試劑有限公司）；乙腈，色譜/光譜純（MERCK，德國）。

稻瘟酰胺標準品純度為98.2%，江蘇豐登農藥有限公司提供。

1.2 溶液配制

準確稱取0.050 9 g稻瘟酰胺標準品于50 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得到1 000 mg/L的農藥標準儲備液備用。農藥標準工作溶液由上述標準溶液用乙腈稀釋制得。

1.3 空白樣品采集與保存

空白土壤樣品：選擇未施用稻瘟酰胺的稻田土樣，采集 0～10 cm 深土壤，過篩后混勻，用四分法分取200 g樣品，貼好標簽，-20 ℃低溫中貯存。

空白水樣：選擇未檢測出稻瘟酰胺的環境水樣，采集 500 mL 水樣，充分混勻，裝入樣品瓶中，貼好標簽，-20 ℃低溫中貯存。

空白魚體樣品：選擇空白未含有稻瘟酰胺的斑馬魚轉入樣品袋中，貼好標簽，-20 ℃低溫中貯存。

1.4 樣品前處理

土壤樣品提取：向待測土壤樣品中加入30 mL丙酮，混勻后25 ℃振蕩處理0.5 h，6 000 r/min離心5 min留取上清液。土樣重復提取1次，合并上清液，于旋轉蒸發儀上蒸發除去丙酮后轉入250 mL分液漏斗中，再加入30 mL乙酸乙酯，振蕩提取，靜置分層后，收集上層有機相；下層溶液再用30 mL乙酸乙酯萃取1次。合并有機相，旋蒸至近干，N2吹干后用乙腈定容，過0.45 μm濾膜，待液相色譜測定。

水樣提取：取20 mL水樣，加入適量氯化鈉搖勻，倒入250 mL分液漏斗中，分別用20 mL 乙酸乙酯提取2次，合并乙酸乙酯相，蒸干，用乙腈定容后，過0.45 μm濾膜，待液相色譜儀測定。

魚體提取：取2 g左右魚樣置于瑪瑙研缽中，加入10 g無水硫酸鈉，充分研磨后，將樣品轉入150 mL三角瓶中，并加入50 mL乙腈，置于恒溫振蕩器以200 r/min 的速率振搖1 h，過濾后，魚樣再用乙腈振蕩提取1次，合并提取液。提取液經旋轉蒸發至近干，用乙腈溶解后，于-20 ℃冰凍10 min去脂，過0.45 μm濾膜待高效液相色譜測定。

1.5 HPLC測定條件

色譜柱250 mm×4.6 mm，5 μm ODS-2 HYPERSIL柱，柱溫30 ℃；流動相 ∶V乙腈 ∶V水=80 ∶20，流速1 mL/min；進樣量 20 μL，檢測波長228 nm。上述條件下，稻瘟酰胺的保留時間為4.2 min。采用外標法進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法優化

對空白稻田土壤做加標回收試驗（ 稻瘟酰胺加標量為1.0 mg/kg），分別考察乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷對目標物的萃取效果。試驗表明：乙酸乙酯作萃取劑時，稻瘟酰胺的加標回收率可達85%，樣品雜質峰干擾較小；以正己烷作萃取劑時，回收率不到70%；二氯甲烷作萃取劑時，稻瘟酰胺的加標回收率可達85%，但是樣品雜質峰干擾較多，且萃取液容易存在乳化現象，對穩定性具有較大影響。故選擇乙酸乙酯為土壤樣品的萃取劑。

對空白環境水樣做加標回收試驗（ 稻瘟酰胺的加標量為0.5 mg/L），分別考察乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷對目標物的萃取效果。結果表明，與土壤加標回收結果類似，乙酸乙酯的綜合效果比正己烷和二氯甲烷要好，故選用乙酸乙酯萃取稻田水樣品中的目標物。

對空白魚體樣品做加標回收試驗（ 稻瘟酰胺的加標量為1.0 mg/kg），分別考察丙酮、乙腈、乙腈 （冷凍去脂） 混合溶液作萃取劑時的萃取效率。試驗表明：用丙酮作萃取劑時，稻瘟酰胺的加標回收率能達到90%，但雜質干擾較多；乙腈作萃取劑（不冷凍）時，樣品中的脂肪雜質較多，干擾較大，影響出峰效果；乙腈作萃取劑時，且經過冷凍去脂后，回收率均達到75%，且雜質干擾較少。故選用乙腈-冷凍去脂法萃取魚體樣品。

2.2 色譜方法選擇

色譜柱選擇常規的250 mm×4.6 mm，5 μm ODS-2 HYPERSIL反相柱。依據稻瘟酰胺物化性質，用乙腈作為溶劑溶解樣品，并選擇乙腈和水作為流動相。將流動相按不同比例在色譜柱上進行試驗，最終確定流動相為V乙腈 ∶V水=80 ∶20，在流速1.0 mL/min時，有效成分與雜質能很好地分離，峰形對稱，基線平穩，能在短時間得到滿意的分析結果，提高了工作效率。

2.3 標準曲線繪制

用乙腈依次稀釋稻瘟酰胺標準溶液，配制質量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的工作溶液，在“1.5”節條件下進行測定，標準溶液色譜圖見圖2。

以質量濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，標準工作曲線見圖3。結果表明，在0.5～10.0 mg/L范圍內，不同組分的色譜峰面積（y）與稻瘟酰胺質量濃度（x，mg/L）呈現良好的線性關系。回歸方程為y=39 325x+69.905（r2=1.000）。

2.3 方法回收率與最低檢測濃度

在上述色譜條件下，稻瘟酰胺儀器最小檢出量為1.0×10-11 g，土壤最小檢測濃度為0.05 mg/kg，水中最小檢測濃度為0.01 mg/L，魚體中最小檢測濃度為0.05 mg/kg。

按上述方法對空白土壤、水樣和魚體中進行加標回收試驗，土壤回收率結果見表1，水中回收率結果見表2，魚體中回收率結果見表3。從表1、表2、表3可以看出，當土壤中添加水平為1.0～10.0 mg/kg時，稻瘟酰胺在紅壤、黑土和水稻土中的平均回收率在83.9%～91.7%范圍內，相對標準偏差為0.4%～4.8%，該方法對不同土壤均具有較高的回收率；當水中添加水平為0.5～5.0 mg/L時，平均回收率在89.4%～91.9%范圍內，相對標準偏差為2.5%～2.8%；當魚體中添加水平為0.10～10.0 mg/kg時，平均回收率在76.5%～101.7%范圍內，相對標準偏差為6.7%～10.5%。上述結果表明，該方法具有較好的準確度和精確度，其準確度及精確度均滿足農藥殘留分析試驗的要求[13-14]。

3 結論

采用液相色譜法同時測定環境樣品土壤、水和魚體中的稻瘟酰胺殘留量，優化后的前處理方法簡便、高效，且不受樣品中的雜質干擾。在所確定的提取、凈化及檢測條件下得到的結果表明，土壤中稻瘟酰胺的平均回收率為83.9%～91.7%，相對標準偏差為0.4%～4.8%；水中稻瘟酰胺的平均回收率為89.4%～91.9%，相對標準偏差為2.5%～2.8%；魚體中稻瘟酰胺的平均回收率為76.5%～101.7%，相對標準偏差為6.7%～10.5%。該方法簡便，準確度、靈敏度較高，能夠滿足稻瘟酰胺在環境中殘留分析的要求。

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