香菇多糖的化學結構與抗氧化活性分析

魏元

摘要：對香菇多糖（Lentinus edodes polysaccharides，LPS）經過離子交換柱層析和凝膠柱層析法得到的2種組分（LPS-1和LPS-2）的化學結構特征進行分析，旨在為香菇多糖的構效關系研究提供依據。采用高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜（GC）、紅外光譜（IR）分析等手段對其化學結構特征進行解析，并對其抗氧化活性進行分析。構成糖分析結果顯示，LPS-1單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其物質量之比為 1.52 ∶2.96 ∶2.91 ∶0.78 ∶1.00 ∶1.35；LPS-2的單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖，其物質量之比為2.91 ∶1.00 ∶1.10 ∶0.20 ∶0.50。LPS-1和LPS-2均有較強的抗氧化活性，LPS-2更為顯著。結果表明，香菇多糖主要是阿拉伯糖和鼠李糖組成的吡喃型多糖，有較強的抗氧化活性。

關鍵詞：香菇；多糖；化學結構；抗氧化

中圖分類號： R284.1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0305-04

香菇（Lentinus edodes）別稱花菇、香菌、香蕈、冬菇、香菰，屬真菌門（Eumycophyta）側耳科（Pleurotaceae）香菇屬（Lentinus），是世界第二大食用菌。香菇口味鮮美、營養豐富、富含多種生物活性物質，如多糖、維生素、蛋白質、多元酚、樸菇素、膳食纖維等。香菇多糖是香菇中最重要的一種生物活性物質，作為一種免疫促進劑，已引起人們廣泛的興趣。香菇多糖的生物學功能主要有以下幾方面：抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、免疫調節、抗炎、保肝護肝和降血糖等[1-2]。有關香菇多糖的藥理研究，特別是結構方面的研究已引起國內外學者的高度關注，并成為多糖領域的研究熱點。本研究對香菇多糖（Lentinus edodes polysaccharides，LPS）通過DEAE-52纖維素柱和 G-100 葡聚糖多糖進行分離純化，分別研究了LPS-1和LPS-2的分子量、單糖組成、鍵型和抗氧化活性，為香菇多糖的研究開發及利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗材料 本研究所用的香菇多糖是以山東榮豐食用菌有限公司生產的香菇為材料，經過熱水浸提、乙醇沉淀、透析等方法分離而成。

1.1.2 試驗試劑

30%H2O2（天津市凱通化學試劑有限公司）；95%乙醇（天津市百世化工有限公司）；DPPH（Sigma公司）；DEAE-52纖維素（Sigma公司）；葡聚糖G-100（Sigma公司）；苯酚（天津市天大化學試劑廠）；濃硫酸（淄博化學試劑廠有限公司）；濃鹽酸（淄博化學試劑廠有限公司）；三氯乙酸（天津大茂化學試劑廠）。

1.1.3 試驗儀器

752-N紫外可見分光光度計（上海精宏實驗設備有限公司）；GC2010氣相色譜儀（日本島津公司）；TDL-5-A型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；Nicolet380傅立葉變換紅外光譜儀（美國熱電集團）；DK-S24型恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；LXJ-68-02型離心機（北京醫療儀器修理廠）；DZF-6021型真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 多糖的提取

利用水提醇沉法提取香菇多糖。

1.3 成分含量測定

總糖含量采用苯酚-硫酸法[3]測定。

1.4 多糖的凝膠柱層析

首先采用DEAE-纖維素離子交換柱對多糖進行分離純化，用濃度梯度為0.2、0.5、1.0 mol/L的NaCl溶液洗脫，洗脫速度控制在1 mL/min，每個洗脫梯度收集25管，每管收集2 mL，利用苯酚-硫酸法測定收集到的多糖溶液濃度，繪制洗脫曲線。然后用葡聚糖G-100凝膠柱對多糖進行進一步的分離純化和純度鑒定[4]。用0.1 mol/L NaCl溶液充分平衡層析柱后，用蒸餾水作為洗脫劑，洗脫速度控制在 0.1 mL/min，每管收集2 mL，同樣利用硫酸-苯酚法對收集到的多糖溶液濃度進行測定，繪制洗脫曲線。

1.5 多糖的分子量測定

采用高效液相色譜法（HPLC）對多糖的分子量進行測定[5]。用高效液相色譜儀（1260型，美國安捷倫科技有限公司），SHODEX SB-806 HQ色譜柱Column（8.0 mm×300 mm）及示差折光檢測器測定。流動相為0.2 mol/L NaCl溶液，進樣量為100 μL，流速為0.5 mL/min，柱溫保持 5 ℃。標準品及樣品質量濃度均為2 mg/mL。用葡聚糖系列樣品作為標準品，以lg Mw（分子質量對數）對ET（保留時間）繪制標準曲線，得線性回歸方程：lg Mw=1-0.342 9ET+11.975，r2=0.999 1。用0.2 mol/L NaCl水溶液將樣品配成濃度為 2 mg/mL 的溶液，上柱測定其保留時間，根據回歸方程計算分子量。

1.6 構成糖分析

糖樣品經過酸加熱完全水解（0.25 mol/L H2SO4、100 ℃、16 h），或者不經過水解處理，按照Blakeney等的方法[6]制備成各單糖的全乙酰化糖醇衍生物，然后進行氣相色譜（GC）分析（日本島津公司的島津GC-14C、柱溫210℃、N2流速 30 mL/min），分離柱為日本島津公司的毛細管柱DB-1（0.25 mm×30 m）。

1.7 多糖的紅外光譜（IR）分析

多糖的IR分析儀采用鉑金埃爾默儀器有限公司的 Spectrun GXFT-IR紅外光譜分析系統。樣品采用KBr壓片法進行測定。

1.8 多糖的體外抗氧化分析

多糖對DPPH自由基的清除率測定反應體系如下：2 mL乙醇（質量濃度95%）或DPPH（0.1 μmol/L），2 mL不同濃度的多糖溶液（100～1000 mg/L）。反應混合物在25 ℃水浴 15 min，在517 nm處測定吸光度[7]。羥基自由基清除能力測定采用Smironff等的方法[8]。多糖還原力的測定采用Oyaizu等的方法[9]。

2 結果與分析

2.1 香菇多糖的組分分離純化

采用DEAE-纖維素柱對LPS進行組分分離，分別利用蒸餾水和0.2、0.5、1.0 mol/L NaCl溶液作為流動相對LPS洗脫，如圖1所示，得到2個組分（LPS-1和LPS-2）。對經過DEAE-纖維素分離得到的2個組分用葡聚糖G-100凝膠做進一步分離。如圖2所示，LPS-1和LPS-2均分離得到1個單一的洗脫峰，表明LPS-1和LPS-2均為純多糖。對LPS-1和LPS-2進行紫外光譜掃描（ultravialet spectrum，UV），試驗結果顯示LPS-1和LPS-2在280 nm處有特征吸收峰，表明2種組分可能是以糖蛋白的形式存在。

2.2 化學結構分析

用高效液相色譜分析多糖分子量，可知LPS-1的數均分子量為5.77×104 u，重均分子量為5.47×104 u，Z均分子量為7.16×105 u，Z+1均分子量為8.97×105 u；LPS-2的數均分子量為4.58×103 u，重均分子量為1.77×103 u，Z均分子量為1.55×104 u，Z+1均分子量為4.49×104 u（圖3）。

根據標樣的保留時間來測定單糖的含量，由表1可知，LPS-1主要含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，它們的含量分別為 11.4%、30.0%、27.1%、8.0%、9.1% 、14.3%，其物質量之比為1.52 ∶2.96 ∶2.91 ∶0.78 ∶1.00 ∶1.35，從這些數據可以看出，LPS-1含量最多的單糖是阿拉伯糖和木糖。LPS-2主要含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖，它們的含量分別為44.7%、20.9%、19.9%、3.6%、10.8%，其物質量之比為2.91 ∶1.00 ∶1.10 ∶0.20 ∶0.50，可以看出LPS-2含量最多的單糖是鼠李糖和阿拉伯糖。

由圖4可知，LPS-1在2 927.76 cm-1和3 418.64 cm-1附近有明顯的吸收峰，主要由—OH和C—H的伸縮振動引起[10]。而1 642.63 cm-1處的吸收峰說明LPS-1中含有酰胺羰基。1 371.95 cm-1處吸收峰為CO對稱伸縮振動引起，1 415.40 cm-1處吸收峰為C—H變角振動引起，在 1 023.73、1 082.21、1 156.03 cm-1處的吸收峰是糖環上的C—O和O—H伸縮振動引起，這表明LPS-1中存在D-吡喃環[11]。760.15 cm-1處的吸收峰主要由D-葡萄糖吡喃環對稱環伸縮振動引起，930.25 cm-1處的吸收峰主要由D-葡萄糖吡喃環非對稱環伸縮振動引起。

由圖5可知，在2 923.65 cm-1和3 441.87 cm-1附近有較強的吸收峰，2個峰分別由—OH和C—H的伸縮振動引起[10]。在1 416.11 cm-1處吸收峰為C—H變角振動引起，1 623.67 cm-1處的吸收峰說明LPS-2中含有酰胺羰基。在1 156.11、1 079.99、1 024.15 cm-1處的為C—O和O—H伸縮振動引起的，這表明多糖中含有D-吡喃環[11]。

2.3 2種組分的體外抗氧化活性

2.3.1 LPS-1和LPS-2對DPPH·的清除作用

圖6為LPS-1和LPS-2對DPPH·的清除作用，在濃度為 100 μg/mL 時，LPS-1和LPS-2對DPPH·的清除率分別為（29.35±0.69）%和（74.21±1.65）%。據報道，當濃度為100 μg/mL時，靈芝多糖對DPPH·的清除率為15.00%[12]。LPS-2的EC50為（48±0.05） μg/mL遠遠高于靈芝多糖（1 000.00 μg/mL）[12]。結果表明，LPS-2對DPPH·具有較高的清除率。

2.3.2 LPS-1和LPS-2對羥基自由基的清除作用

LPS-1和LPS-2對羥基自由基的清除作用見圖7。在100 μg/mL時LPS-1和LPS-2對羥基自由基的清除率分別為（12.51±1.02）%和（69.94±4.81）%。據相關報道，當濃度為 100 μg/mL 時，靈芝多糖對羥基自由基的清除率為 29.00%[13]，白靈菇多糖對羥基自由基的清除率為 39.50%[14]。即LPS-2對羥基自由基的清除作用是靈芝多糖的2.41倍，白靈菇多糖的1.77倍。

LPS-2的EC50為（69.00±0.05） μg/mL（P<0.01），比靈芝菌絲體多糖低240.00 μg/mL[13]，比白靈菇低 640.00 μg/mL[14]，結果表明LPS-2對羥基自由基有較強的清除能力。

2.3.3 LPS-1和LPS-2的還原力測定

由圖8可見，在100 μg/mL時，LPS-1和LPS-2在700 nm處測得的還原力分別為0.22±0.003和0.42±0.05，LPS-2的還原力比白靈菇、金針菇、美味牛肝菌分別高0.37、0.25、0.24[15]。說明2種組分都具有非常強的還原力，LPS-2的還原力更為顯著。

3 結論

在本試驗中，經過DEAE-纖維素離子交換柱和葡聚糖G-100凝膠柱的分離，LPS分離得到多糖組分分別為LPS-1和LPS-2。利用氣相色譜法測定了LPS-1和LPS-2單糖的組成。發現LPS-1中主要含有阿拉伯糖和木糖，LPS-2中主要含有鼠李糖和阿拉伯糖，LPS-1和LPS-2中阿拉伯糖的含量都比較高。但是在結構分析中，通過紅外光譜法對LPS-1、LPS-2在4 000～400 cm-1區段進行掃描，結果顯示，2種多糖均為D-吡喃型。其中，在LPS-2中檢測到脂肪族C—H伸縮振動特征峰和非對稱的SO伸縮振動特征峰，說明多糖可能是以含有硫酸酯的脂多糖形式存在。由于抗氧化劑對不同的氧化劑或自由基的作用原理不同，所以目前沒有單一的方法可以一次性準確地反映出所有抗氧化劑或自由基的作用機制。因此，在本試驗中選取了羥基自由基清除能力、還原力和DPPH·清除能力3個指標對香菇多糖組分的體外抗氧化活性進行測定。結果顯示，LPS-1和LPS-2對DPPH·、羥基自由基均有較強的清除能力；兩者均有較強的還原力，并且LPS-2的體外抗氧化活性更強。

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