響應面法優化具有抑菌活性的大麥乳酸菌發酵工藝

姚芳+肖香+董英

摘要：通過單因素試驗探討了乳酸菌添加量、發酵溫度、發酵時間、料液比、提取液對大麥乳酸菌發酵物抑菌效果的影響；并以大腸桿菌為指標菌，進一步通過響應面分析對大麥乳酸菌發酵液抑菌效果的發酵條件進行優化。結果表明，大麥乳酸菌發酵液最佳抑菌效果出現在料液比1 ∶7（g ∶mL）、發酵溫度30.5 ℃、菌種添加量27.5 g/kg、發酵時間25.5 h。在此條件下，抑菌圈直徑為17.52 mm，與模型預測值17.56 mm基本一致。

關鍵詞：大麥；乳酸菌；抑菌活性；發酵條件

中圖分類號： TS201.1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0296-06

微生物污染導致的食品腐敗變質，是食品貯藏保鮮過程中的關鍵問題。目前延長食品保藏期的主要方法是添加化學防腐劑或一些物理方法，如干燥、冷藏、熱處理等[1]。而物理的保藏方法強度過大會降低食品品質，已知的化學防腐劑具有一定危害，因此生物防腐成為研究熱點。近年來，乳酸菌的生物轉化功能越來越受到人們關注，尤其是其代謝產物的抑菌功能[2-3]。

大麥是我國傳統的藥食兼用作物，產量位居世界糧食作物第4位，但我國大麥的主要用途是啤酒釀造和飼料工業，僅有10%左右的大麥用于食用，利用率十分低下[4]。已有研究表明，大麥含有β-葡聚糖、黃酮、多酚類化合物、大麥芽堿等多種活性成分，具有清除自由基、抗衰老、抑菌、降血糖、降血脂、抗癌等功能[4-6]。但是，目前有關大麥微生物轉化利用的研究較少，其活性功能尚不明確。大麥是乳酸菌發酵的良好基質[7]，經乳酸菌發酵后大麥中葉酸、γ-氨基丁酸、可溶性膳食纖維等營養活性成分含量顯著升高[8]；大麥中含有的多酚類物質[9]經乳酸菌發酵后，由結合態轉化為游離態，從而發酵產物的多酚明顯增加[10]。Funamoto等發現，大麥燒酒蒸餾后的殘留物具有抗腫瘤和免疫活性[11-12]；Baek等發現，用2株乳酸菌發酵大米粉制作的年糕，其發酵產物對霉菌具有抑制作用[13]，Ross等認為，乳酸菌發酵碳水化合物能夠產生豐富的有機酸類（如乳酸、乙酸、丙酸、苯甲酸、香草酸等），能夠抑制部分致病菌及腐敗菌的生長[14-15]。這些酸的抑菌效果是通過降低體系pH值、抑制菌體生長和代謝而實現的[16]。此外，乳酸菌抑菌蛋白及其衍生物的抑菌能力的研究也有不少報道[17-18]。然而，利用植物乳桿菌發酵大麥，研究其發酵產物抑菌活性，國內外未見報道。本研究以抑菌圈直徑為追蹤指標，對影響大麥乳酸菌發酵液抑菌活性的各因素進行研究，采用響應面法優化具有抑菌活性的乳酸菌發酵大麥的最佳工藝，旨在提升大麥的生理活性功能，為大麥的高效利用和天然抑菌產品的開發開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大麥：新鮮脫殼大麥，購自江蘇省鹽城市雙增農化科技有限公司。

乳酸菌：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum Dy-1，CGMCC No.6016），由江蘇大學食品與生物工程學院實驗室分離貯藏。

菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、青霉菌（Penicillium expansum），均為江蘇農牧科技職業學院食品科技學院實驗室保藏菌種。

1.2 培養基

MRS培養基：1.0%牛肉膏、0.5%酵母膏、1.0% 蛋白胨、2.0%葡萄糖、0.5%乙酸鈉、0.2%檸檬酸銨、0.2% K2HPO4、0.058% MgSO4·7H2O、0.025% MnSO4·H2O、0.1%吐溫80、1 L蒸餾水，pH值6.2～6.4，瓊脂1.5%，115 ℃滅菌 25 min，用于培養乳酸菌。

牛肉膏蛋白胨培養基：0.3%牛肉膏、1.0%蛋白胨、0.5% NaCl、1.5%瓊脂、1 L水，pH值7.0～7.2，115 ℃滅菌25 min，用于培養大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。

PDA培養基：馬鈴薯20%（去皮切塊后煮沸30 min，取濾液），葡萄糖2.0%，瓊脂1.5%，蒸餾水定容至1 L，115 ℃滅菌25 min，用于培養霉菌。

牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、瓊脂為生化試劑，其他為分析純，均購自中國醫藥（集團）上海化學試劑有限公司，馬鈴薯購自市場。

1.3 試驗儀器

高速萬能粉碎機，天津市華鑫儀器廠；SPX-250S-Ⅱ型生化培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面垂直凈化工作臺，吳江市亞泰凈化設備有限公司；臺式冷凍干燥機，美國LABCONCO公司；PRIMOR型高速冷凍離心機，美國Thermo Fisher公司；BS-IE型振蕩培養箱；上海一恒科技有限公司；AUTOCLAVE·G154DWS型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申勝生物技術有限公司；AL204型電子天平，上海躍進醫療器械廠；EL3002型電子天平，上海申勝生物技術有限公司；0～150 mm游標卡尺，無錫錫工量具有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 大麥乳酸菌發酵物的制備

將新鮮的大麥脫殼磨粉過篩，按料液比1 ∶7（g ∶mL）混合均勻，添加2%的乳酸菌凍干粉，攪拌均勻，30 ℃發酵1 d，8 000 r/min離心 20 min，收集上清液，冷凍干燥后，即為大麥乳酸菌發酵物。

1.4.2 樣品抑菌液的制備

將大麥乳酸菌發酵物凍干粉用蒸餾水配制成50 mg/mL的溶液，在超凈臺中過0.22 μm的膜，即得樣品抑菌液。

1.4.3 供試菌懸液的制備

無菌條件下，用劃線法將供試菌種（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌）分別接種到相應培養基上，將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌用牛肉膏蛋白胨培養基置36 ℃恒溫培養箱中培養1 d，將青霉菌用PDA培養基置 30 ℃ 恒溫培養箱中培養2 d，用接種環挑取適宜的菌落，用無菌生理鹽水梯度稀釋，獲得1×105～1×106 CUF/mL的菌懸液。

1.4.4 抑菌效果的測定

采用打孔法[19]測定抑菌效果，具體方法：在直徑9 cm的培養皿中倒入滅菌后的培養基，凝固后加入200 μL相應的供試菌懸液，涂布均勻，用直徑6 mm的打孔器在涂布好菌液的平板上打4個分布均勻的小孔，對3個孔中加入100 μL的樣品抑菌液，對另1個孔加空白對照液。將細菌于37 ℃恒溫培養1 d，將真菌于28 ℃恒溫培養 2 d，采用十字交叉法測定抑菌圈2個垂直方向的直徑，取其平均值為測定結果，抑菌圈直徑越大說明抑菌效果越好。每項抑菌試驗重復3次。以上操作均在無菌超凈臺上完成。

1.4.5 單因素試驗

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌為供試菌，以抑菌圈直徑為指標，研究提取溶劑、料液比、菌種添加量、發酵時間、發酵溫度對大麥乳酸菌發酵液抑菌活性的影響，每組試驗重復3次。

1.4.6 響應面試驗

根據單因素試驗結果設定因素水平，采用Design-Expert 8.05b軟件中的Box-Behnken法設計試驗方案，選取影響抑菌效果的4個主要因素（料液比、發酵時間、菌種添加量、發酵溫度）進行4因素3水平的響應面試驗，以對大腸桿菌的抑菌圈直徑為響應值，因素水平見表1。

1.5 數據分析

采用Design-Expert 8.05b軟件對數據進行二次多元回歸擬合，利用F檢驗對數據進行方差分析以評價模型的統計意義。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取劑的選擇

采用蒸餾水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等5種提取劑對大麥乳酸菌發酵物中的抑菌活性物質進行提取，制成50 mg/mL的溶液，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌為供試菌，分別以相應的提取劑為空白溶液，研究不同大麥乳酸菌發酵提取液的抑菌性能，扣除空白溶液抑菌圈后的結果見表2。

由表2可知，不同大麥乳酸菌發酵提取液對供試菌的抑菌效果順序為大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>青霉菌，水提取液對3種供試菌的抑菌效果最好，且與其他溶劑提取液相比有顯著差異。說明水提取液中有效抑菌物質較多，且水提取液能代表大麥乳酸菌發酵液中所有成分，因此后續試驗直接用大麥乳酸菌發酵液為樣品。

2.1.2 料液比對大麥乳酸菌發酵液抑菌活性的影響

設定20 g/kg的乳酸菌接種量，30 ℃發酵1 d，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌為供試菌，研究不同料液比對大麥乳酸菌發酵液抑菌活性的影響。由圖1可知，隨料液比增加，大麥乳酸菌發酵液對3種供試菌的抑菌活性呈先增強后減弱的趨勢，料液比為1 g ∶7 mL時對青霉菌的抑菌效果最好，在料液比為1 g ∶8 mL時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，這可能是因為含水量少不利于乳酸菌對大麥的充分發酵，含水量太多會導致大麥乳酸菌發酵液中的抑菌活性物質的相對含量減少，從而減弱了抑菌效果。因此，選擇料液比 1 g ∶6 mL、1 g ∶7 mL、1 g ∶8 mL進一步優化。

2.1.3 發酵時間對大麥乳酸菌發酵液抑菌活性的影響

設定料液比為1 g ∶7 mL，乳酸菌接種量為20 g/kg，30 ℃發酵，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌為供試菌，研究不同發酵時間對大麥乳酸菌發酵液抑菌活性的影響。由圖2可知，隨著發酵時間延長，大麥乳酸菌發酵液對3種供試菌的抑菌活性呈先增強后緩慢減弱的趨勢，發酵時間在20 h時對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，在24 h時對大腸桿菌、青霉菌的抑菌效果最好，這可能是因為發酵時間短時產生的抑菌活性成分少，發酵時間太長會導致一些抑菌活性成分又被代謝利用，因此選擇發酵時間為20、24、28 h進一步優化。

2.1.4 菌種添加量對大麥乳酸菌發酵液抑菌活性的影響

設定料液比為1 g ∶7 mL，30 ℃發酵1 d，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌為供試菌，研究不同菌種添加量對大麥乳酸菌發酵液抑菌活性的影響。由圖3可知，隨著乳酸菌接種量增加，大麥乳酸菌發酵液對3種供試菌的抑菌活性呈先增強后平緩的趨勢，在菌種添加量為20 g/kg時，對3種供試菌的抑菌活性達到較大；隨著接種量繼續增加，抑菌效果并未有明顯變化。乳酸菌接種量是影響大麥發酵產抑菌物質的關鍵因素，乳酸菌接種量小，產生的代謝產物少；乳酸菌接種量大時，發酵產物迅速積累，酸度也迅速上升，當酸度上升至一定水平時，乳酸菌生長受到影響[20]，抑菌物質的量也會趨于平穩。因此，選擇乳酸菌接種量為10、20、30 g/kg進一步優化。

2.1.5 發酵溫度對大麥乳酸菌發酵液抑菌活性的影響

設定料液比為1 g ∶7 mL，乳酸菌接種量為20 g/kg，發酵1 d，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌為供試菌，研究不同發酵溫度對大麥乳酸菌發酵液抑菌活性的影響。

由圖4可知，隨著發酵溫度升高，大麥乳酸菌發酵液對3種供試菌的抑菌活性呈先增強后減弱的趨勢。在發酵溫度為30 ℃時，對3種供試菌的抑菌活性達到最大；但發酵溫度為26～38 ℃時抑菌圈直徑變化不顯著，可能是因為乳酸菌在此溫度范圍內都能生長。溫度偏低時，乳酸菌生長緩慢，發酵時間延長；溫度偏高時，會影響發酵過程中某些酶的活性，降低抑菌物質的產生。因此，選擇發酵溫度為26、30、34 ℃進一步優化。

2.2 大麥乳酸菌發酵工藝的響應面試驗分析

2.2.1 響應面分析方案及結果

大麥乳酸菌發酵工藝條件的響應面分析試驗根據Box-Behnken設計進行了29組試驗，其中5組中心點重復試驗，結果見表3，回歸模型的方差分析見表4。

從表4可知，該模型的F值為102.85，P值小于0.000 1，顯著性檢驗結果表明二次回歸模型對抑菌圈直徑的影響高度顯著。試驗中一次項X1、X2、X3、X4和二次項X12、X22、X32、X42對抑菌圈直徑的影響極顯著，說明各試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，料液比、發酵時間、菌種添加量、發酵溫度對大麥乳酸菌發酵液的抑菌效果有極顯著影響。由統計學計算出的模型相關系數R2值為0.990 4，說明模型有很好的精密度；模型校正決定系數R2Adj為0.980 7，說明該模型能解釋98.07%響應值的變化，僅有總變異的1.93%不能用此模型來解釋，說明該模型與實際試驗的擬合程度好，用該模型對具有抑菌活性的大麥乳酸菌發酵工藝條件進行優化是合適的。R2Pred為0.944 9，說明該模型預測性良好，能很好地預測影響大麥乳酸菌發酵液抑菌效果的各因素對抑菌圈直徑的影響。

2.2.2 響應面因素間的交互作用分析

根據回歸模型，將任意2個因素固定在零水平， 可以得到體現另外2個因素及其交互作用影響的響應面曲線圖及對應的等高線圖（圖5）。

曲面圖的形狀可反映出單因素對響應值的影響，曲面越陡峭，影響越顯著，擬合的響應面圖和等高線圖比較直觀地反映了各因素間的交互作用。由圖5可知，以對大腸桿菌的抑菌圈直徑為響應值，各因素對大麥乳酸菌發酵液抑菌效果的影響順序為菌種添加量>發酵時間>料液比>發酵溫度，與表4中F值分析結果一致。菌種添加量、料液比、發酵溫度過高或過低和發酵時間過長或過短，都不能使大麥乳酸菌發酵液的抑菌效果達到最大，只有其取某個適中值時，才可使抑菌圈直徑達到最大值。沿菌種添加量軸線等高線相對密集，表明菌種添加量對抑菌效果的影響最大。圖5-a、圖5-d中等高線密度分布不均勻，呈橢圓形，說明發酵時間和料液比、發酵時間和菌種添加量的交互作用較強，影響較顯著。

2.3 驗證試驗

根據Box-Behnken試驗所得的大麥乳酸菌發酵工藝參數結果和二次多項回歸方程，利用Design Expert 8.05b軟件中的“Optimization”模塊分析得出優化結果，即獲得較好抑菌效果的工藝參數為料液比1 g ∶7 mL，發酵時間25.5 h，菌種添加量27.5 g/kg，發酵溫度30.53 ℃，大麥乳酸菌發酵液對大腸桿菌的抑菌圈直徑預測可達到17.56 mm。考慮實際操作便利，將發酵工藝參數修正為料液比1 g ∶7 mL，發酵時間25.5 h，菌種添加量27.5 g/kg，發酵溫度30.5 ℃。采用修正后的發酵工藝參數進行3次平行驗證試驗，結果測得抑菌圈直徑為17.52 mm，可見該模型能較好地預測具有抑菌活性的大麥乳酸菌發酵工藝參數，具有實用價值。

3 結論

本研究在單因素試驗基礎上，以大腸桿菌為指標菌，以抑菌圈直徑為響應指標，通過四因素三水平的響應分析對大麥乳酸菌發酵工藝進行了優化，建立了大麥乳酸菌發酵工藝的二次多項式回歸模型。經方差分析和響應面圖得知，各因素對抑菌效果影響的大小順序為菌種添加量>發酵時間>料液比>發酵溫度，料液比、發酵時間、菌種添加量、發酵溫度對大麥乳酸菌發酵液的抑菌效果有極顯著影響。經回歸分析并結合實際操作便利性，確定大麥乳酸菌發酵的最佳工藝為料液比1 g ∶7 mL，發酵時間25.5 h，菌種添加量27.5 g/kg，發酵溫度30.5 ℃。在此條件下，抑菌圈直徑為17.52 mm，與模型預測值17.56 mm基本一致，說明該模型可靠性較高，對乳酸菌發酵大麥的生產實踐有一定的指導意義。大麥乳酸菌發酵液可作為一種天然的抑菌產品添加到其他食品中，提升了大麥的使用價值。

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