1—脫氧野尻霉素對(duì)家蠶中腸BmSuc1基因表達(dá)及其酶活性的影響

楊偉克+唐芬芬+劉增虎

摘要：為研究1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，簡(jiǎn)稱DNJ）對(duì)家蠶中腸BmSuc1基因表達(dá)及其酶活性的影響，以5齡第3天家蠶為試驗(yàn)材料，經(jīng)口添食不同劑量的生物堿DNJ，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)中腸BmSuc1的表達(dá)情況，同時(shí)測(cè)定β-呋喃果糖苷酶的活性。結(jié)果表明，添食不同劑量的DNJ均能引起B(yǎng)mSuc1基因在添食6、9 h出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，但相對(duì)表達(dá)量有一定差異，添食4 μg/頭的處理組在添食6、9 h基因的相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照組的1.9、2.9倍，添食2 μg/頭的處理組在添食6、9 h基因的相對(duì)表達(dá)量分別僅為對(duì)照組的1.5、1.8倍。另外，添食4 μg/頭的處理組β-呋喃果糖苷酶活性在添食6、9、12 h顯著高于對(duì)照組，而添食2 μg/頭的處理組酶活性僅在添食6、9 h顯著高于對(duì)照組。由結(jié)果可知，酶活性變化與基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)規(guī)律基本一致。

關(guān)鍵詞：家蠶；DNJ；BmSuc1；β-呋喃果糖苷酶；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類號(hào)： S881.2；Q786 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0290-03

1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，簡(jiǎn)稱DNJ）屬于哌啶類多羥基生物堿，它能夠抑制α-葡萄糖苷酶，具有一定的降血糖功能[1]。研究發(fā)現(xiàn)，多種植物、微生物中均有DNJ及其類似物存在[2-3]，其中桑樹中生物堿DNJ的含量遠(yuǎn)高于其他植物[4-5]。

蔗糖是包括昆蟲在內(nèi)的動(dòng)物非常喜好的主要糖營(yíng)養(yǎng)來源，分解蔗糖的水解酶有2種：一種是催化葡萄糖側(cè)基的α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase），另一種是催化果糖側(cè)基的β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase）[6]。DNJ能夠抑制α-葡萄糖苷酶活性，而對(duì)β-呋喃果糖苷酶沒有抑制作用。DNJ能夠通過抑制昆蟲腸道α-葡萄糖苷酶活性，阻止其分解和吸收蔗糖營(yíng)養(yǎng)，使其不能正常生長(zhǎng)發(fā)育，甚至死亡[7]。已有研究表明，生物堿DNJ對(duì)非食桑昆蟲卷心菜蛾、蓖麻蠶具有強(qiáng)烈的毒害作用[8-9]。

Daimon等率先在家蠶基因組中發(fā)現(xiàn)了β-呋喃果糖苷酶同源基因BmSuc1，其編碼的中腸蛋白酶具有蔗糖水解酶功能，且活性不受DNJ的抑制[10]。桑樹的葉片、枝條和根莖等部位富含DNJ[11]，寡食性昆蟲家蠶一生以桑葉為食物來源[12-13]，它能夠克服生物堿毒性，正常吸收桑葉中的糖營(yíng)養(yǎng)，主要依賴β-呋喃果糖苷酶充分分解吸收桑葉中的蔗糖營(yíng)養(yǎng)，從而成功地避開桑葉生物堿DNJ對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用[10]。

本研究通過添食外源DNJ，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)家蠶中腸BmSuc1基因的表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)和分析，同時(shí)測(cè)定β-呋喃果糖苷酶的變化規(guī)律，探討外源DNJ對(duì)BmSuc1基因表達(dá)及其酶活性的影響，為深入研究家蠶回避桑葉生物堿DNJ毒害作用的適應(yīng)機(jī)制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

供試家蠶品種為菁松×皓月，來自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所。主要試劑：MiniBEST Universal RNA Extraction Kit和M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO公司），F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master（Roche公司），生物堿DNJ（Sigma公司），蛋白定量測(cè)試盒和蔗糖水解酶測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所），其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 添食處理及樣品采集 選取發(fā)育良好、體質(zhì)量和大小相當(dāng)?shù)募倚Q5齡第3天幼蟲，采用經(jīng)口喂食的方法進(jìn)行生物堿DNJ添食，其中A組喂食劑量為2 μg/頭，B組喂食劑量為4 μg/頭，以添食滅菌水的家蠶為對(duì)照，添食后在同等條件下飼喂。

取添食后3、6、9、12、24 h家蠶的中腸組織，對(duì)照組同時(shí)取材，每次取樣均分成2份，1份用于抽提RNA，另外1份用于制備酶液，每次取樣均設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取5頭蠶，樣品收集后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 按照MiniBEST Universal RNA Extraction Kit操作說明提取中腸組織RNA。在核酸蛋白分析儀上測(cè)定D260 nm、D280 nm、D260 nm/D280 nm值，計(jì)算RNA樣品濃度，根據(jù)M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明書將抽提的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。另外取D260 nm/D280 nm值在1.80～2.00之間的樣品，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 利用Primer Premier 5.0軟件，按照Real-Time PCR要求對(duì)選取的家蠶內(nèi)參基因Actin3及目標(biāo)基因BmSuc1進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。Actin3引物序列為F：5′-CGGGAAATCGTTCGTGAT-3′，R：5′-ACGAGGGTTGGAAGAGGG-3′；BmSuc1引物序列為F：5′-AATCCAGTCCTCTCCTACGTGC-3′，R：5′-TCCGGTCTGATACGTGTTCT-TG-3′。

熒光定量PCR方法參照FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒操作說明進(jìn)行。反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。用ABI公司StepOne熒光定量PCR擴(kuò)增儀記錄試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。根據(jù)公式2-ΔΔCT計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[14]，其中ΔΔCT=（CTBmSuc1-CTActin3）處理-（CTBmSuc1-CTActin3）對(duì)照。式中：CTBmSuc1、CTActin3分別代表靶標(biāo)基因BmSuc1、內(nèi)參基因Actin3在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)過程中擴(kuò)增的CT值。

1.2.4 β-呋喃果糖苷酶活性測(cè)定 酶液的制備：取家蠶中腸樣品，加入4 ℃預(yù)冷的1.0 mL磷酸鉀緩沖液（0.1 mol/L，pH值7.0），在冰上勻漿，4 ℃、8 000 r/min離心5～8 min，收集上清。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定按照蛋白定量試劑盒操作進(jìn)行。測(cè)定原理是蛋白質(zhì)分子具有—NH3+基團(tuán)，當(dāng)棕紅色的考馬斯亮蘭顯色劑加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品中時(shí)，考馬斯亮蘭染料上的陰離子與蛋白—NH3+結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{(lán)色，通過測(cè)定595 nm處吸光度可計(jì)算出蛋白含量。計(jì)算公式：待測(cè)樣品蛋白濃度（g/L）=[（D595 nm試驗(yàn)-D595 nm對(duì)照）/（D595 nm標(biāo)準(zhǔn)-D595 nm空白）]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.563 g/L）。每個(gè)樣品重復(fù)3次，取其平均值，下同。

酶活測(cè)定原理是β-呋喃果糖苷酶能水解相應(yīng)的底物產(chǎn)生單糖，該單糖在相應(yīng)氧化酶的作用下產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫同顯色劑結(jié)合產(chǎn)生紅色絡(luò)合物，用分光光度計(jì)在505 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)以下公式計(jì)算酶性：酶活性（U/mg）=[（D505 nm試驗(yàn)-D505 nm對(duì)照）/（D505 nm標(biāo)準(zhǔn)-D505 nm空白）]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（5.55 mmol/L）÷反應(yīng)時(shí)間（20 min）÷待測(cè)樣品蛋白濃度×1 000。具體操作參照蔗糖水解酶活性測(cè)定試劑盒說明書。酶活力定義：在37 ℃、pH值為7.0的條件下，1 mg蛋白組織1 min內(nèi)水解1 nmoL蔗糖定義為1個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 添食DNJ對(duì)家蠶中腸BmSuc1基因表達(dá)的影響

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，對(duì)添食不同劑量生物堿DNJ后家蠶中腸BmSuc1基因的表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)和分析。試驗(yàn)中采取的是相對(duì)定量計(jì)算方法，將對(duì)照組BmSuc1基因的相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1.0，當(dāng)添食組BmSuc1基因的相對(duì)表達(dá)量大于1.0時(shí)即為上調(diào)表達(dá)，若小于1.0時(shí)即為下調(diào)表達(dá)。從圖1可以看出，添食不同劑量（2、4 μg/頭）的生物堿DNJ均能引起家蠶中腸BmSuc1表達(dá)量在6、9 h出現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢(shì)，其中處理6 h相對(duì)表達(dá)量最高，而處理3、12、24 h基因相對(duì)表達(dá)量變化不明顯，均接近對(duì)照組BmSuc1基因的相對(duì)表達(dá)量1.0。

對(duì)比A、B 2個(gè)處理組可知，添食劑量越高基因表達(dá)量上調(diào)幅度越大，其中添食量4 μg/頭的B組，BmSuc1相對(duì)表達(dá)量在6、9 h分別是對(duì)照組的1.84、2.97倍，而添食量2 μg/頭的A組，在6、9 h BmSuc1的相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照組的1.58、2.19 倍（圖1）。

2.2 添食DNJ對(duì)家蠶中腸β-呋喃果糖苷酶活性的影響

添食不同劑量生物堿DNJ后，由圖2可見，不同劑量生物堿DNJ處理家蠶，均能引起β-呋喃果糖苷酶活性出現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。添食量4 μg/頭的處理組（B組），在6、9、12 h時(shí)酶活性與對(duì)照組相比，差異均達(dá)到顯著水平，其中在處理6 h時(shí)，酶活性最高。而添食量2 μg/頭的處理組（A組），在處理9 h時(shí)酶活性最高，并且僅在6、9 h時(shí)酶活性與對(duì)照組的差異達(dá)到顯著水平。

由圖2還可以看出，添食量4 μg/頭的處理組（B組），酶活性上升速度較快，而下降速度較慢，在處理6 h就達(dá)到最高值，隨后在9、12 h繼續(xù)維持一個(gè)相對(duì)較高的水平，在24 h酶活性仍高于對(duì)照組，但差異未達(dá)到顯著水平。添食量 2 μg/頭的處理組（A組）酶活性上升速度較慢，而下降速度較快，在添食9 h酶活性升至最高值，隨后急劇降低，在12 h已低于對(duì)照組，雖然在24 h的酶活性高于對(duì)照組，但差異并不顯著。

3 討論與結(jié)論

桑葉的乳液中含有大量的DNJ、1，4-二脫氧-1，4-亞氨基-D-阿拉伯糖醇（簡(jiǎn)稱D-AB1）等糖類似物生物堿[11]，其中DNJ是一種強(qiáng)效的α-葡萄糖苷酶抑制劑，而動(dòng)物體內(nèi)的蔗糖消化吸收主要依賴于α-葡萄糖苷酶的水解作用[15]。研究表明，添食DNJ能導(dǎo)致一些昆蟲喪失吸收和利用蔗糖的能力，從而對(duì)其產(chǎn)生一定的毒害作用[8-9]。β-呋喃果糖苷酶屬于另一類蔗糖水解酶，廣泛存在于真菌、細(xì)菌、酵母菌和植物中[6]，它也能催化蔗糖水解產(chǎn)生葡萄糖、果糖，并且其活性不受DNJ抑制[11]。家蠶BmSuc1是第1個(gè)被分子克隆和功能鑒定的動(dòng)物β-呋喃果糖苷酶基因[10]。

家蠶主要依賴β-呋喃果糖苷酶充分分解吸收桑葉中的蔗糖營(yíng)養(yǎng)，所以桑葉中高濃度的DNJ對(duì)家蠶沒有毒害作用，也不影響家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育[10]。另外家蠶自身具有一定富集DNJ的能力，其富集部位主要集中在血淋巴、消化管和體壁[16-18]。但蠶體DNJ的富集、代謝機(jī)制目前還不明確，筆者推測(cè)DNJ進(jìn)入蠶體后，一部分被蠶體吸收利用，另一部分隨自身代謝產(chǎn)物排出體外。

家蠶無論是富集吸收DNJ，還是代謝利用DNJ，均需要能量。BmSuc1編碼的β-呋喃果糖苷酶主要是水解家蠶體內(nèi)的蔗糖，為機(jī)體提供糖源和能量，因此添食外源DNJ后，BmSuc1基因在一定時(shí)間范圍內(nèi)被上調(diào)表達(dá)，同時(shí)β-呋喃果糖苷酶活性顯著高于對(duì)照組。隨著時(shí)間的推移，進(jìn)入蠶體的DNJ逐漸被富集及代謝利用，其含量也相應(yīng)減少，機(jī)體不需要消耗過多能量去應(yīng)對(duì)，BmSuc1基因表達(dá)量及β-呋喃果糖苷酶活性恢復(fù)至接近對(duì)照組水平，維持機(jī)體正常的生命活動(dòng)。

本研究表明，生物堿DNJ能誘導(dǎo)家蠶BmSuc1基因的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)β-呋喃果糖苷酶的活性，并且基因的表達(dá)規(guī)律與酶活性變化趨勢(shì)一致。本試驗(yàn)中2種添食處理組，基因上調(diào)表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)是一致的，都是在添食后6、9 h，但表達(dá)量卻有所差異，添食DNJ的劑量越大，基因表達(dá)量越高。β-呋喃果糖苷酶活性也是在添食6、9 h顯著高于對(duì)照組；另外，添食量4 μg/頭的處理組（B組），12 h的酶活性也顯著高于對(duì)照組，這表明DNJ劑量越大，對(duì)酶活性的影響時(shí)間越長(zhǎng)。DNJ對(duì)家蠶中腸BmSuc1基因表達(dá)及其酶活性的影響是否與DNJ劑量有一定的相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。

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