干旱脅迫下外源甜菜堿對(duì)石榴光合作用、滲透調(diào)節(jié)及保護(hù)酶活性的影響

范春麗+羅青

摘要：選用2年生泰山紅石榴為試驗(yàn)材料，用200 mmol/L濃度甜菜堿葉面噴施，研究干旱脅迫下噴施甜菜堿對(duì)石榴光合作用、滲透調(diào)節(jié)及抗氧化酶響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，干旱脅迫下，噴施甜菜堿提高了石榴葉片可溶性糖、游離脯氨酸含量，同時(shí)提高蘋果幼樹滲透調(diào)節(jié)能力；提高了超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）抗氧化酶活性，降低了丙二醛（MDA）、H2O2積累，緩解了干旱脅迫對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的傷害；同時(shí)，提高葉片相對(duì)含水量、葉綠素含量，使葉片光合能力增強(qiáng)。甜菜堿提高蘋果幼樹抗旱性的主要作用機(jī)制，是對(duì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)及對(duì)抗氧化酶等生物大分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)的保護(hù)。

關(guān)鍵詞：外源甜菜堿；干旱；石榴；光合作用；滲透調(diào)節(jié)；保護(hù)酶

中圖分類號(hào)： S665.401 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0229-04

近年來，河南省降水量呈減少趨勢(shì)，年降水分布不均勻，干旱對(duì)果樹生產(chǎn)影響越來越嚴(yán)重[1]。干旱脅迫打破葉片水分平衡，造成水分代謝碳代謝失衡，影響植物一系列代謝活動(dòng)[2]，相關(guān)研究表明，干旱脅迫導(dǎo)致氣孔導(dǎo)度（Gs）降低，凈光合速率（Pn）下降[3]。長時(shí)間的干旱脅迫導(dǎo)致保護(hù)酶失活， O-2·、丙二醛（MDA）等積累，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，發(fā)生光破壞[4-6]。

長期的進(jìn)化使植物形成一整套的生理生化機(jī)制幫助其抵御不良的外界環(huán)境。其中，滲透調(diào)節(jié)、抗氧化酶是植物抵抗干旱環(huán)境的重要手段[7]。相關(guān)研究表明，抗旱能力較強(qiáng)的品種擁有較高的滲透調(diào)節(jié)能力及抗氧化酶活性， O-2· 、H2O2等有害物質(zhì)積累較少，同時(shí)光合能力較高[8-10]。據(jù)報(bào)道，施用某些外源物質(zhì)是增強(qiáng)植物抗旱能力的有效手段，如施用鈣、殼聚糖、硅等[11-13]。甜菜堿是一種季銨類化合物，是重要的細(xì)胞相溶性物質(zhì)，干旱脅迫下在許多植物細(xì)胞內(nèi)大量積累，其生理功能主要是參與細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)，參與穩(wěn)定生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能，影響離子在細(xì)胞內(nèi)的分布和吸收等[14]。施用甜菜堿能夠有效提高作物抗旱性，相關(guān)研究在小麥、玉米、煙草等上有較多的報(bào)道[15-17]。

石榴是果樹開發(fā)的重要樹種，目前關(guān)于石榴的研究主要集中在育種、果實(shí)組分及果色形成機(jī)制等方面，對(duì)于抗逆性的研究較少，尤其關(guān)于甜菜堿調(diào)節(jié)石榴抗旱性方面研究更是鮮見報(bào)道[18-19]。本研究以2年生石榴幼樹為試驗(yàn)材料，研究干旱脅迫下施用外源甜菜堿，石榴幼樹光合作用、滲透調(diào)節(jié)、酶促調(diào)節(jié)復(fù)合響應(yīng)，以期為提高石榴抗旱能力提供技術(shù)支持。

1 材料與方法[LL]

1.1 材料

試驗(yàn)材料為泰山紅石榴（Punica granatum L. ‘Taishanhong），長勢(shì)一致，2年生，取自河南省河陰石榴基地。2014年3月中旬栽植于盆口直徑40 cm、高35 cm的塑料花盆中，挖20 cm土穴，將盆埋入，防止高溫對(duì)根系的影響。基質(zhì)配比為園土 ∶有機(jī)肥 ∶細(xì)沙=3 ∶1 ∶1，每盆基質(zhì)15 kg，田間持水量21.5%，有機(jī)質(zhì)含量14.3 g/kg，全氮含量2.2 g/kg，速效磷含量 39.8 mg/kg，速效鉀含量118.4 mg/kg。置于避雨棚內(nèi)，每株樹留取相同枝量（5根枝條），自然條件下生長。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2015年5月下旬進(jìn)行試驗(yàn)處理，選取20株于傍晚澆透水后停止?jié)菜M(jìn)行干旱處理，第2天（土壤相對(duì)含水量85%～75%）進(jìn)行第1次采樣，用烘干稱質(zhì)量法測(cè)土壤相對(duì)含水量，并進(jìn)行光合測(cè)定，此后每隔1 d用烘干稱質(zhì)量法測(cè)量土壤相對(duì)含水量，在土壤相對(duì)含水量達(dá)到60%～50%、45%～35%、30%～20%時(shí)進(jìn)行取樣并進(jìn)行光合測(cè)定。試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理：（1）處理組，選取待干旱處理的10株樹，干旱處理前葉面噴施200 mmol/L甜菜堿（本研究采用甘氨酸甜菜堿，簡(jiǎn)稱GB經(jīng)預(yù)試驗(yàn)200 mmol/L效果最好），連續(xù)噴施5 d，至開始干旱處理結(jié)束，08：00、20：00定時(shí)2遍噴施；（2）對(duì)照（CK），選取待干旱處理的10株樹噴施去離子水，噴施方法同處理組。取樣時(shí)選取枝條中部功能葉片采樣。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 光合作用測(cè)定 取營養(yǎng)枝，以生長點(diǎn)為起始點(diǎn)選取第6～8節(jié)位功能葉，作為待測(cè)葉片，重復(fù)15次。利用TPS-2光合儀（Hansatech，英國），晴天09：00—11：00測(cè)定光合參數(shù)，包括光合速率、氣孔導(dǎo)度、細(xì)胞間隙二氧化碳濃度（Ci）等。

1.3.2 葉片相對(duì)含水量（RWC）、葉綠素含量（Chl）測(cè)定 葉片相對(duì)含水量采用稱質(zhì)量法[20]測(cè)定；葉綠素含量測(cè)定采用95%乙醇浸泡法[21]。

1.3.3 保護(hù)酶活性測(cè)定 超氧化物歧化酶（SOD）活性采用NBT法[22]測(cè)定；過氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定采用紫外吸收法[22]；抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性采用趙世杰等方法[22]測(cè)定。

1.3.4 丙二醛（MDA）、H2O2含量測(cè)定 MDA采用硫代巴比妥酸法[22]測(cè)定；H2O2含量測(cè)定采用可見光法試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3.5 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量測(cè)定 可溶性糖含量采用蒽酮比色法[22]測(cè)定；游離脯氨酸含量采用茚三酮比色法[22]測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）和最小顯著差異法（LSD）比較不同數(shù)據(jù)間的差異。利用Excel 2003軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源甜菜堿對(duì)干旱條件下石榴葉片相對(duì)含水量及葉綠素含量的影響

從圖1可見，干旱脅迫下，CK與處理石榴葉片相對(duì)含水量、葉綠素含量隨脅迫加重呈降低趨勢(shì)。但是土壤相對(duì)含水量低于45%以后甜菜堿處理組的葉片葉綠素含量顯著高于CK，而土壤相對(duì)含水量60%～50%時(shí)甜菜堿處理組葉片相對(duì)含水量就顯著高于CK。土壤相對(duì)含水量為45%～35%、30%～20% 時(shí)，處理組葉片相對(duì)含水量和葉綠素含量比CK分別提高40.60%、44.24%，32.32%、39.84%。表明干旱條件下施用甜菜堿能有效提高石榴葉片相對(duì)含水量、葉綠素含量。

2.2 外源甜菜堿對(duì)干旱條件下石榴葉片光合能力、光合參數(shù)的影響

從圖2可以看出，干旱對(duì)石榴葉片光合能力影響較大，輕度的干旱即可引起葉片光合功能大幅度下降。經(jīng)甜菜堿處理，葉片Pn下降速度減緩，在3種干旱程度下與CK相比較差異顯著，Pn分別提高17.19%、40.38%、399.40%。噴施甜菜堿能夠有效地提高干旱脅迫下石榴葉片的光合能力。Gs變化趨勢(shì)與Pn一致，呈下降趨勢(shì)，Ci先降低后升高，光合能力下降的影響因子由氣孔因素過渡到非氣孔因素，在3種脅迫程度下，處理與CK差異顯著。

2.3 外源甜菜堿對(duì)干旱條件下石榴葉片滲透調(diào)節(jié)的影響

從圖3可以看出，隨著干旱程度加重，可溶性糖含量呈升高趨勢(shì)，游離脯氨酸含量呈先升高后下降的趨勢(shì)。表明干旱脅迫誘導(dǎo)石榴啟動(dòng)滲透調(diào)節(jié)，可溶性糖含量等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增加，以抵御干旱環(huán)境。在3種干旱程度下，甜菜堿處理組可溶性糖含量、游離脯氨酸含量顯著高于CK。在土壤相對(duì)含水量分別為60%～50%、45%～35%、30%～20%時(shí)，處理葉片可溶性糖含量分別提高34.92%、29.56%、22.87%，游離脯氨酸含量分別提高33.27%、46.11%、35.42%。表明干旱脅迫下噴施甜菜堿能夠調(diào)節(jié)石榴葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝，促進(jìn)可溶性糖、游離脯氨酸積累，提高了石榴的抗旱能力。

2.4 外源甜菜堿對(duì)干旱條件下石榴葉片保護(hù)酶活性的影響

從圖4可以看出，3種保護(hù)酶（SOD、CAT、APX）活性變化規(guī)律一致，隨干旱程度加重，呈先升高后下降的趨勢(shì)。石榴接收環(huán)境干旱信號(hào)，在土壤相對(duì)含水量60%～50%時(shí)，3種抗氧化酶活性達(dá)到最大，隨后干旱加重，3種酶活性降低。甜菜堿處理組3種抗氧化酶活性表現(xiàn)出同CK相同的趨勢(shì)，但是在相同干旱程度下，甜菜堿處理組3種酶活性顯著高于CK，說明干旱脅迫下外源甜菜堿能夠維持抗氧化酶較高的活性，提高石榴抗旱能力。

2.5 外源甜菜堿對(duì)干旱條件下石榴葉片丙二醛及過氧化氫活性的影響

干旱脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞活性氧代謝，H2O2作為抗氧化酶清除活性氧自由基的產(chǎn)物逐漸積累，活性氧自由基對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生傷害，其中MDA是衡量膜損傷的指標(biāo)。從圖5可以看出，隨著干旱程度加重，葉片中MDA、H2O2含量隨著干旱程度加重逐漸升高，表明細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損愈加嚴(yán)重。與CK比較，土壤相對(duì)含水量在60%～20%條件下，甜菜堿處理組MDA、H2O2含量顯著降低，在干旱程度最嚴(yán)重時(shí)，甜菜堿處理組MDA、H2O2含量分別比CK降低27.94%、20.28%。表明干旱脅迫條件下噴施甜菜堿可有效減少有害物質(zhì)積累，緩解膜損傷。

3 討論

干旱脅迫下，植物根系吸收水分能力降低，導(dǎo)致地上部葉片相對(duì)含水量下降，葉片失水，維持氣孔開張的膨壓降低，導(dǎo)致氣孔導(dǎo)度下降，植物光合能力下降，此時(shí)氣孔限制是影響光合能力下降的主要因素[23-24]。隨著干旱脅迫加重，ROS積累，產(chǎn)生氧化脅迫，ROS不僅導(dǎo)致光合膜結(jié)構(gòu)損傷并且與葉綠素降解有關(guān)[25-26]，從而影響光合作用光反應(yīng)，使植物光合能力下降，此時(shí)非氣孔限制是引起光合能力下降的主要因素。本研究中根據(jù)Pn、Gs、Ci的變化[27]，土壤相對(duì)含水量50%以下，非氣孔限制是光合能力下降的主要因素，干旱導(dǎo)致葉綠素含量下降，MDA、H2O2含量升高，膜結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重。

據(jù)相關(guān)報(bào)道，甜菜堿對(duì)蛋白和色素具有保護(hù)作用[28]，甜菜堿處理的小麥單位葉面積的色素含量顯著高于未施用外源甜菜堿的小麥幼苗[29]；侯彩霞等研究表明，外源甜菜堿能夠維持D1蛋白等大分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[30]；趙新西等報(bào)道，甜菜堿能夠減輕脅迫對(duì)類囊體膜的損傷[15]；黃義春等報(bào)道，外源甜菜堿能顯著提高干旱脅迫下玉米SOD等抗氧化酶活性[16]。本研究也發(fā)現(xiàn)，甜菜堿處理顯著提高了石榴葉片SOD、CAT、APX抗氧化酶活性，MDA含量降低，膜損傷減輕，H2O2積累減少。甜菜堿對(duì)酶蛋白的保護(hù)作用，使抗氧化酶保持在較高的活性，及時(shí)清除干旱產(chǎn)生的ROS，緩解了ROS對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的氧化損傷，另一方面ROS可能參與Chl 4-吡咯環(huán)的破壞[26]，ROS的減少，可能是葉綠素含量增加的原因之一。

干旱脅迫下，絕大多數(shù)植物啟動(dòng)滲透調(diào)節(jié)以抵御干旱環(huán)境[31-32]。植物的滲透調(diào)節(jié)是通過在細(xì)胞中合成積累具有滲透活性而又無毒的有機(jī)物來實(shí)現(xiàn)的，這些有機(jī)物可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)水分維持和從外部吸收水分[33]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，噴施甜菜堿能夠促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖、游離脯氨酸的積累，提高了樹體吸水能力，葉片相對(duì)含水量顯著增加，改善了葉片水分狀況，為光化學(xué)反應(yīng)和電子傳遞提供適當(dāng)?shù)纳憝h(huán)境，這可能是噴施甜菜堿提高光合效率的原因之一。

綜上所述，干旱脅迫下噴施甜菜堿能夠減少細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷，提高葉片葉綠素含量，緩解干旱對(duì)光合電子傳遞鏈抑制，從而維持較高的光合能力，提高石榴抗旱性。甜菜堿調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)代謝，促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)，改善了樹體水分狀況對(duì)生物大分子的保護(hù)作用，可能是干旱脅迫下甜菜堿處理使葉片維持較高光合能力、提高樹體抗旱性的主要原因。

參考文獻(xiàn)：

[1]韓 瑋，韓永紅，楊沈斌. 1961—2011年山東氣候資源及氣候生產(chǎn)力時(shí)空變化特征[J]. 地理科學(xué)進(jìn)展，2013，32（3）：425-434.

[2]董 蕾，李吉躍. 植物干旱脅迫下水分代謝、碳饑餓與死亡機(jī)理[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，33（18）：5477-5483.

[3]溫國勝，張國盛，吉川賢. 干旱脅迫對(duì)臭柏水分特性的影響[J]. 林業(yè)科學(xué)，2004，40（5）：84-87.

[4]原向陽，郭平毅，張麗光，等.干旱脅迫下草甘膦對(duì)抗草甘膦大豆幼苗保護(hù)酶活性及脂質(zhì)過氧化作用的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（3）：698-705.

[5]許長成，趙世杰，樊繼蓮，等. 干旱脅迫下大豆與玉米葉片光破壞的防御[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，1998，24（1）：17-23.

[6]Zhao C M，Wang G X. Effects of drought stress on the photoprotection in Ammopiptanthus mongolicus leaves[J]. Acta Botanica Sinica，2002，44（11）：1309-1313.

[7]Wei L M，Jia L R，Hu X A. Advances in studies on the physiology and biochemistry of maize drought resistance[J]. Agricultural Research in the Arid Areas，1997，15（4）：66-71.

[8]李德全，鄒 琦，程炳嵩. 土壤干旱下不同抗旱性小麥品種的滲透調(diào)節(jié)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，1992，18（1）：37-44.

[9]Dong L，Li J Y，Wang J H，et al. Effect of drought stress on osmotic regulation substances of five Catalpa bungei clones[J]. Agricultural Science Technology，2013，14（9）：1335-1343.

[10]Ramachandra R A，Chaitanya K V，Vivekanandan M. Drought-induced responses of photosynthesis and antioxidant metabolism in higher plants[J]. Journal of Plant Physiology，2004，161（11）：1189-1202.

[11]胡景江，張林森，劉建朝. 干旱及外源低聚殼聚糖對(duì)1年生蘋果幼樹滲透調(diào)節(jié)能力的影響[J]. 林業(yè)科學(xué)，2012，48（9）：15-21.

[12]李清芳，馬成倉，尚啟亮. 干旱脅迫下硅對(duì)玉米光合作用和保護(hù)酶的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，18（3）：531-536.

[13]張會(huì)慧，張秀麗，許 楠，等. 外源鈣對(duì)干旱脅迫下烤煙幼苗光系統(tǒng)Ⅱ功能的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，22（5）：1195-1200.

[14]張立新，李生秀. 甜菜堿與植物抗旱/鹽性研究進(jìn)展[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2004，24（9）：1765-1771.

[15]趙新西，馬千全，楊興洪，等. 根施甜菜堿對(duì)干旱脅迫下小麥幼苗類囊體膜組分和功能的影響[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2005，31（2）：135-142.

[16]黃義春，李建民，段留生，等. 甜菜堿對(duì)玉米幼苗抗旱性的誘導(dǎo)效應(yīng)[J]. 玉米科學(xué)，2011，19（1）：95-100.

[17]馬新蕾，王玉軍，謝勝利，等. 根施甜菜堿對(duì)水分脅迫下煙草幼苗光合機(jī)構(gòu)的保護(hù)[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2006，32（4）：465-472.

[18]Lansky E P，Newman R A，Punica G. And its potential for prevention and treatment of inflammation and cancer[J]. Journal of Ethnopharmacology，2007，109（3）：177-206.

[19]Aviram M，Volkova N，Coleman R，et al. Pomegranate phenolics from the peels，arils，and flowers are antiatherogenic：studies in vivo in atherosclerotic apolipoprotein e-deficient（E0） mice and in vitro in cultured macrophages and lipoproteins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（3）：1148-1157.

[20]Huang B R，Gao H W. Physiological response of diverse tall fescue cultivars to drought stress[J]. Hort Science，1999，34（5）：897-901.

[21]李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社，2000：134-138.[HJ1.75mm]

[22]趙世杰，史國安，董新純. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，1998.

[23]Flexas J，Bota J，Galmés J，et al. Keeping a positive carbon balance under adverse conditions：responses of photosynthesis and respiration to water stress[J]. Physiologia Plantarum，2006，127（3）：343-352.

[24]Gallé A，Haldimann P，F(xiàn)eller U. Photosynthetic performance and water relations in young pubescent oak（Quercus pubescens） trees during drought stress and recovery[J]. New Phytologist，2007，174（4）：799-810.

[25]劉 強(qiáng)，王占武，周曉梅. 兩種枸杞對(duì)NaCHO3脅迫的抗性生理響應(yīng)[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，38（6）：165-169.

[26]Jiangm Y，Yang W Y，Xu J. Active Oxygen damage effect of chlorophyll degradation in rice seedlings under osmotic stress[J]. Acta Botanica Sinica，1994，36：289-295.

[27]李潮海，趙亞麗，楊國航，等. 遮光對(duì)不同基因型玉米光合特性的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，18（6） ：1259-1264.

[28]Makela P，Karkkainen J，Somersalo S. Effects of glycinebetaine on chloroplast ultra structure，chlorophyll and proteincontent，and RuBPCO activities in tomato grown underdrought or salinity[J]. Biologia Plantarum，2000，43（3）：471-475.

[29]郭啟芳，馬千全，孫 燦，等. 外源甜菜堿提高小麥幼苗抗鹽性的研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2004，24（9）：1680-1686.

[30]侯彩霞，徐春和，湯章城. 甜菜堿對(duì)PSⅡ放氧中心結(jié)構(gòu)的選擇性保護(hù)[J]. 科學(xué)通報(bào)，1997，42（17）：1857-1859.

[31]熊搖潔，鄒曉芬，鄒小云，等. 干旱脅迫對(duì)不同基因型油菜農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31（3）：494-499.

[32]靳搖容，張愛君，史新敏，等. 干旱脅迫下鉀對(duì)甘薯幼苗光合特性及根系活力的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，30（5）：992-996.

[33]Friedman R，Altman A. The effect of salt stress on polyamine biosynthesis and content in mung bean plants and in halophytes[J]. Physiologia Plantarum，1989，76（76）：295-302.