大櫻桃潰瘍病病原菌的分離純化和鑒定

張鵬鵬+李園園+劉露

摘要：為研究大櫻桃潰瘍病的發(fā)病機制，明確其病原菌種類及其生物學特性，從山東省青島市黃島區(qū)張家樓鎮(zhèn)采集了幾株發(fā)病的大櫻桃樹枝條，從其腐爛交接口取樣篩選出1株導致大櫻桃樹潰瘍病的病原菌YT-2。根據(jù)柯赫氏法則驗證了YT-2的致病性，通過觀察形態(tài)學特征，并提取ITS序列進行分析，將YT-2的ITS序列在NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，并利用MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，對YT-2菌株進行鑒定。結果發(fā)現(xiàn)，病原菌YT-2的形態(tài)特征與葡萄座腔菌相符，ITS序列與已發(fā)布的葡萄座腔菌的ITS序列相似度達到100%，系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果也與之相同。說明引起山東省青島市大櫻桃潰瘍病的病原為葡萄座腔菌，尤其是對長勢旺盛的布魯克斯大櫻桃品種危害最為嚴重。

關鍵詞：葡萄座腔菌；布魯克斯大櫻桃；rDNA-ITS；有性型；潰瘍病

中圖分類號： S436.629 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0145-03

櫻桃是原產于歐洲的古老樹種[1]，大櫻桃因具有較高的營養(yǎng)價值，口味鮮美而成為人們最喜愛的水果之一。隨著大櫻桃產量的增加，現(xiàn)在的供求關系已由原來供不應求變?yōu)楣┐笥谇?，因此消費者對櫻桃的內在品質要求也越來越高。布魯克斯大櫻桃因具有早熟、大果脆甜的特點，日益引起消費者的關注和青睞，成為目前銷量最好的櫻桃新品種之一[2]，因此研究布魯克斯大櫻桃的病蟲害對今后櫻桃種植業(yè)的發(fā)展具有重大意義。然而在山東省青島市黃島區(qū)張家樓鎮(zhèn)的大櫻桃園里，布魯克斯大櫻桃植株出現(xiàn)根腐、枝干干腐、流膠、葉片發(fā)黃等一系列潰瘍病病癥，并且發(fā)病集中于1～2年的幼苗。發(fā)病迅速，樹干干枯，營養(yǎng)物質得不到運輸，造成整株死亡，大櫻桃植株成片死亡，給櫻桃園造成嚴重的經濟損失。因為潰瘍病的病原菌種類較多、癥狀表現(xiàn)多樣、危害巨大、發(fā)生期蔓延面廣且迅速，并且采用市面上的殺蟲劑、殺菌劑均無明顯的改善作用，較難控制等，使其成為林業(yè)種植和病害防治的重難點[3]。因此，找出病害的根源并鑒定出該病原菌，為大櫻桃的綜合防治提供理論基礎尤為重要。

目前已有的報道表明，樹木潰瘍類病害危害的生態(tài)、經濟林木主要有楊樹、蘋果、梨樹、石榴、松樹等[4]。我國的樹木潰瘍病主要是由真菌引發(fā)的，目前研究表明，引起樹木潰瘍病的病原真菌類群主要有葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria Cas.）、瘍殼孢屬（Dothichiza Lib.）、殼囊孢屬（Cytospora Ehrenb.）、盾殼霉屬（Coniothyrium Sacc.）等4屬真菌，這些真菌也成為阻礙我國現(xiàn)階段林業(yè)發(fā)展的有害生物。其中，分布范圍最廣泛的葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria sp.）因對樹木的影響最大、危害最嚴重，而成為導致樹木潰瘍病最主要的病原真菌，也成為目前在我國受到最廣泛關注的重大生物災害之一。但迄今為止，葡萄座腔菌屬在大櫻桃樹上發(fā)病的情況并不多見，目前還未見相關報道。

1 材料與方法

1.1 標樣采集與分離

2014年6—7月于山東省青島市黃島區(qū)張家樓鎮(zhèn)大櫻桃園潰瘍病發(fā)病區(qū)域采集標樣，采集時沿病斑周圍將整個發(fā)病枝條取下，完整保存整個病斑，記錄發(fā)病癥狀、采集時間、地點、樹齡、胸徑、危害程度，于4 ℃冰箱保存。

在無菌超凈工作臺內將采集的病斑枝條切成5 mm×5 mm 的小塊，用75%乙醇消毒2 min，0.1%的氯化汞消毒 5 min，然后在無菌水中清洗幾次，以防止氯化汞殘留。將消毒處理好的病斑塊放入含有抗生素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每皿2塊，28 ℃下培養(yǎng)，待菌落直徑長至2 cm時，挑取菌落邊緣未被污染的少許菌絲轉接于新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進行純化，將純化后菌株轉入試管，置于4 ℃冰箱中保存，以便下一步研究。

1.2 菌株的致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則，以健康品種為易感病的品種布魯克斯大櫻桃枝條作為接種對象，檢測分離病原菌的致病性。取直徑約2 cm的2年生枝條，截成25 cm段，用75%乙醇進行表面消毒、晾干，用灼燒滅菌處理后的直徑6 mm的打孔器刺入枝條，形成1個燙傷傷口，將同樣大小的病原菌菌餅放入傷口處，然后用保鮮膜密封，對照組則用無菌PDA餅處理。將枝條上端用保鮮膜密封后插入盛有水的燒杯，放入培養(yǎng)箱中 28 ℃ 下培養(yǎng)，每天進行觀察，記錄是否發(fā)病以及發(fā)病特征。

1.3 病原菌菌落與菌絲特征

1.3.1 菌落特征觀察

將分離純化后的菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，觀察并記錄菌落生長快慢、菌落形狀、質地、氣生菌絲特征、正背面顏色、有無色素沉積、有無特殊氣味等。

1.3.2 菌絲形態(tài)觀察

采用斜面插片法，使菌絲生長至斜插在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的蓋玻片上，取出蓋玻片在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.3.3 孢子觀察

將培養(yǎng)基上產生的子實體置于載玻片上，先用解剖刀切開子實體，加上1滴蒸餾水，再用解剖針將其撥開，使孢子散落在載玻片上，簡單染色后，在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)。

2 結果與分析

2.1 病原物的分離培養(yǎng)

病斑組織在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上培養(yǎng)3 d，在邊緣切口處長出菌絲，經馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基多次純化后得到3個純培養(yǎng)物YT-1、YT-2、YT-3。

2.2 致病性測定

利用上述3株菌株進行致病性測定（回接試驗），結果發(fā)現(xiàn)只有菌株YT-2能引起枝條潰瘍病的癥狀。枝條感染后出現(xiàn)暗褐色至黑褐色不規(guī)則形病斑，在28 ℃條件下培養(yǎng)5 d后，病斑部位再分離，所獲分離菌株與菌株YT-2完全一致，符合柯赫氏法則。

2.3 病原物的培養(yǎng)性狀及產孢結構觀察

病原菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上長勢最好，而在改良馬丁培養(yǎng)基上生長相對遲緩。氣生菌絲十分發(fā)達，會呈現(xiàn)“峰”狀聳起，菌絲最高可以觸到培養(yǎng)皿蓋；生長初期菌落呈白色，后期呈灰色。在野外病株中可以觀察到該病原菌的有性或無性繁殖結構（圖1）。經近紫外線照射培養(yǎng)后，病原菌可在改良馬丁培養(yǎng)基上產生繁殖體。培養(yǎng)30 d后，菌落表面局部有直徑約1～2 mm的顆粒狀角質化凸起物（分生孢子器）生成，分生孢子紡錘形，單細胞，無色，大小15～20 μm×3～5 μm（圖2-F）。根據(jù)上述病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)學特征，初步鑒定該病原菌為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）。為了進一步確認，利用ITS基因分析方法對病原菌進行分子鑒定。

2.4 病原菌的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

PCR產物瓊脂糖電泳結果顯示，ITS基因片段的大小在540 bp左右（圖3）。序列經BLAST比對后發(fā)現(xiàn)，基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中多個葡萄座腔菌菌株的相似性均達到100%。系統(tǒng)發(fā)育分析（圖4）也表明病原菌株YT-2與已報道葡萄座腔菌種在一個分支內（自展支持率達98%），與葡萄座腔菌屬其他種類遺傳關系相對較遠，結合形態(tài)學鑒定結果，確定YT-2菌株為葡萄座腔菌（B. dothidea）。

3 結論與討論

葡萄座腔菌（B. dothidea）是一種分布十分廣泛的真菌，在世界范圍內均有報道，它不僅可以侵染植物，成為植物的病原菌，也可以寄生在植物組織內成為內生真菌，甚至存活在某些壞死的植物組織上作為腐生菌[1]。作為病原菌，該菌的寄生性比較弱，目前已經有研究報道它能侵染的主要林業(yè)樹木有蘋果、葡萄、松樹、楊樹、黑莓、桃樹、橄欖、芒果等[5-10]，由于不同林木的生理生化性質不同，因此該菌的致病性、林木的抗病性和在二者共生過程中，不同種類的林木產生的防御反應差異也比較大，這很容易造成相同癥狀的不同寄主擁有不同的反應機制；而同種林木因為個體間的生長差異以及不同環(huán)境地域的差異，對同一真菌的反應也不盡相同[11]。因此，葡萄座腔菌引起的病癥也因樹種和樹體自身差異而表現(xiàn)不同，主要的病癥表現(xiàn)為葉斑、枝干潰瘍、枝條枯萎、果實腐爛等。目前研究表明病害多發(fā)生在長勢衰弱的植株上，尤其當植物受到干旱、霜凍或其他病蟲害侵染時發(fā)病率更會極大地提高[12-14]，但是，在本研究中，長勢健壯的大櫻桃植株會迅速感染該病原菌，并且造成植株死亡的嚴重后果，尤其以布魯克斯大櫻桃表現(xiàn)最為明顯，這也是首次發(fā)現(xiàn)葡萄座腔菌可以感染大櫻桃，因此，在大櫻桃上首次發(fā)現(xiàn)葡萄座腔菌，為研究大櫻桃的栽培管理技術奠定了基礎。雖然布魯克斯大櫻桃適應環(huán)境的能力強，但卻是對葡萄座腔菌抗性最弱的品種，在嫁接時應注意消毒殺菌，施用腐熟好的農家肥，并注意做好防寒措施。

葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）真菌的無性型在自然界和實驗室人工條件下培養(yǎng)比較常見，但是有性型在這2種條件下都較少見，尤其是在實驗室條件下，很少能觀察到它的有性型形態(tài)。因此，目前對于該屬真菌主要基于無性型的形態(tài)特征進行分類學鑒定的[15]。但是，葡萄座腔菌種間的形態(tài)十分相似，不易產生有性繁殖結構，葡萄座腔菌的寄主廣泛、容易交叉污染等特點使無性態(tài)區(qū)別十分模糊，并且這些特征也使該類群有性型和無性型種的建立比較混亂，所以單純依靠傳統(tǒng)的鑒定方法有一定的局限性。目前該屬真菌種類的分類學和親緣關系仍不是很清楚，需要進一步深入研究。隨著分子技術的發(fā)展，基因組DNA中的保守序列（LSU、ITS等）已越來越多地應用到該類病原菌的鑒定中。本試驗通過形態(tài)學觀察并對rDNA-ITS序列進行分析，對引起大櫻桃潰瘍病的病原菌進行鑒定，最終確認其為葡萄座腔菌（B. dothidea），為山東省青島地區(qū)大櫻桃潰瘍病的防治奠定了理論基礎。

在進行病原菌鑒定的過程中，本研究主要通過紫外線照射的方法進行人工誘導產孢，最終觀察到該菌株的孢子結構特征，但耗時1個月，時間過長，由于種間的形態(tài)比較相似，鑒定需要有豐富的經驗，難度相對較大。而利用 rDNA-ITS序列分析方法對病原菌進行鑒定，操作不僅簡單，而且快速。但是，因為ITS序列在遺傳變異性上屬于中等保守區(qū)，難以充分顯示葡萄座腔菌種間復雜的相關性和多樣性。所以，在進行病原鑒定時結合形態(tài)學方法作為驗證仍是十分必要的。而且，由于葡萄座腔菌屬真菌侵染寄主的廣泛性，以及不同菌株對于不同寄主致病性的顯著差異，找到能夠快速區(qū)別不同致病力菌株的分子標記或相關方法也是亟待開展的工作。

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