低次煙葉蛋白質—多酚復合物的成分及抗氧化性分析

許春平++冉盼盼++曾穎++譚蘭蘭++申屠洪釬++馬擴彥++戴亞

摘要：采用堿溶酸沉法從烤煙低次煙葉中提取蛋白質-多酚復合物，檢測其中蛋白質含量為350 mg/g，多酚成分包括綠原酸、莨菪葶、蕓香苷，其含量分別為2.1、0.5、2.9 mg/g。對蛋白質-多酚復合物進行抗氧化性檢測。結果表明，在一定范圍內，DPPH·自由基與OH·自由基的清除率隨復合物濃度的增加而升高；對蛋白質-多酚復合物中蛋白質進行酶解，酶解產物的抗氧化性測試結果表明，隨著酶解時間的延長，復合物對DPPH·自由基與OH·自由基的清除活性均呈下降趨勢，說明蛋白質與多酚結合狀態下才能保持蛋白質-多酚復合物的抗氧化性，而且其抗氧化性可能主要來源于復合物中的多酚。

關鍵詞：低次煙葉；蛋白質-多酚復合物；酶解；抗氧化性

中圖分類號：S572 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）03-0531-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.035

Analysis of Composition and Antioxidant Activity of Protein-polyphenol Complex from Discarded Tobacco Leaves

XU Chun-ping1，RAN Pan-pan1，ZENG Ying1，TAN Lan-lan2，SHENTU Hong-qian2，MA Kuo-yan3，DAI Ya3

（1.College of Food and Biological Engineering， Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450002，China；

2.Technical Center of China Tobacco Chuanyu Industrial Co. Ltd.， Chengdu 610066，China；

3.Technical Center of China Tobacco Chongqing Industrial Co. Ltd.， Chongqing 400060，China）

Abstract： The protein-polyphenol complex was extracted from discarded tobacco leaves by alkali-solution and acid-isolation method. The protein content was detected as 350 mg/g and polyphenol components including chlorogenic acid， scopoletin and rutin， and their contents were 2.1 mg/g， 0.5 mg/g， and 2.9 mg/g， respectively. The antioxidant tests of protein-polyphenol complex showed that in a certain range， the scavenging rate of DPPH· radical and OH· radical increased with the increase of the concentration. The scavenging activity of DPPH· radical and OH· radical was decreased with the time of enzymatic hydrolysis. The results indicated that the antioxidant activity of protein-polyphenol can maintain with the binding stage of protein and polyphenol， and the main source of antioxidant activity could be from polyphenols.

Key words： discarded tobacco； protein polyphenol complex； enzymatic hydrolysis； antioxidant activity

中國是煙草種植大國，也是卷煙生產大國，同時每年產生的低次煙葉也數量龐大，有效利用這些廢料既可以保護環境，減輕環境負擔，也能創造更高的經濟價值。煙葉蛋白質是一種優質的蛋白質資源，作為食用蛋白質來說它比雞蛋、乳酪和牛奶更適合人體吸收利用，具有較高的營養價值和藥用價值[1]。Kung等[2]、Lowe[3]對煙葉FI蛋白質進行了提純。趙謀明等[4]使用堿溶酸沉法工藝對煙葉蛋白質進行提取。研究表明，提取出的蛋白質是一種蛋白質多酚復合物[5]，其中多酚成分對其生物活性有較大影響。林曉婕等[5]從煙葉中提取出色素蛋白質復合物，表明其中多酚物質對其抗紫外活性起主要作用。王潔[6]研究表明，蛋白質與多酚以非共價形式結合。本試驗對提取的蛋白質-多酚復合物的組成進行分析，檢測其抗氧化活性，并分析其組成對抗氧化活性的影響，以期為煙葉蛋白質的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

低次烤煙葉粉末（2013年河南襄縣產豫煙10號X3L等級煙葉）。濃鹽酸、Tris、無水乙醇、磷酸、DPPH、鄰二氮菲、PBS磷酸鹽、硫酸亞鐵、H2O2（30%）以上試劑均為分析純；甲醇、乙酸為色譜級；綠原酸、蕓香苷、莨菪葶為標準品（Sigma公司）；中性蛋白酶（200 000 U/g）、堿性蛋白酶（200 000 U/g）（江蘇銳陽生物科技有限公司）；考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白（西安國安生物科技有限公司）；回流裝置、水浴鍋、低速離心機（湘儀TDZ5-WS型）、紫外分光光度計（UV1700PC型）、Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、色譜柱為Waters Symme-try C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質-多酚復合物的提取 按照堿溶酸沉法提取低次煙葉蛋白質-多酚復合物[4，7]，低次煙葉打粉過篩，按料液比1∶30（m∶V，下同）加入去離子水，將pH調至8，在50 ℃溶解30 min，以3 000 r/min離心15 min，取上清液調pH至3，酸沉1 h，再3 000 r/min離心15 min得到沉淀，冷凍干燥即為蛋白質-多酚復合物。

1.2.2 蛋白質含量測定 采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量[8]。標準曲線的繪制：準確配制100 μg/L的標準牛血清蛋白溶液，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用去離子水補至1 mL，然后加入考馬斯亮藍G-250 5 mL，搖勻，放置5 min，在585 nm下比色測定吸光度。以蛋白質濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

樣品檢測：準確稱取冷凍干燥后的蛋白質-多酚復合物0.1 g，將樣品稀釋1 000倍，取1 mL用考馬斯亮藍法測定其吸光度，方法同上，通過標準曲線及稀釋倍數計算蛋白質含量。計算公式為蛋白質含量（mg/g）=（蛋白質濃度×稀釋倍數/1000）/0.1。

1.2.3 蛋白質-多酚復合物中多酚含量的測定 用HPLC對低次煙葉蛋白質-多酚復合物中多酚含量進行測定。準確稱取1.00 g蛋白質復合物，加入150 mL 80%甲醇，回流40 min，取1 mL，通過0.22 μm濾膜過濾，進樣[5]。

定性試驗：標準溶液為80%甲醇配制的0.1 mg/mL綠原酸、0.005 mg/mL莨菪葶、0.1 mg/mL蕓香苷。設置3個試驗，標準樣品為1號，樣品組為2號，樣品組加入0.1 mL標準樣品為3號，進行試驗。

外標標準曲線的繪制：將配制好的綠原酸分別取1.2、1.0、0.8、0.6、0.4 mL定容到10 mL，相同條件下進樣；將上述莨菪葶、蕓香苷也分別取1.2、1.0、0.8、0.6、0.4 mL定容到10 mL進行測定。多酚含量計算方法：多酚含量（mg/g）=多酚濃度×150。

色譜條件：流動相A為水∶甲醇∶乙酸=88∶10∶2（體積比），流動相B為水∶甲醇∶乙酸=10∶88∶2（體積比）。柱溫30 ℃，柱流量1 mL/min，進樣體積20 μL。梯度0 min，流動相A 為100%；16.5 min，A為80%，B為20%；30 min，A為20%，B為80%。檢測器為DAD，檢測波長340 nm，參比波長480 nm，分析時間40 min[9]。

1.2.4 煙葉蛋白質-多酚復合物抗氧化能力的測定 采用DPPH法測定低次煙葉蛋白質-多酚復合物對DPPH·自由基的清除能力[10]。采用鄰二氮菲法測定低次煙葉蛋白質-多酚復合物對OH·自由基的清除能力[11]。

1.2.5 酶解蛋白質-多酚復合物的抗氧化性測定 用中性蛋白酶和堿性蛋白酶1∶1的混合酶，在60 ℃、pH=7、加酶量0.001 g的條件下，對樣品進行酶解，每20 min取一次樣，對酶解液進行抗氧化性檢測，方法同上。

1.3 數據處理

采用SPSS Statistics17.0統計軟件進行統計學分析，均數比較采用Student-t檢驗，顯著性水平P<0.05時差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 蛋白質-多酚復合物中蛋白質含量

以蛋白質濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，如圖1所示。由標準曲線得到線性方程y=0.009 8x+0.044 2，R2=0.992 8。測得稀釋后的樣品吸光度為0.387，由方程及稀釋倍數得到蛋白質-多酚復合物中蛋白質含量為350 mg/g。

2.2 蛋白質-多酚復合物中多酚的檢測

采用HPLC檢測蛋白質-多酚復合物中多酚，結果如圖2所示。樣品中3種成分與標樣中物質保留時間相似，通過標準加入法進一步說明該物質與標樣中物質相同，根據保留時間依次為綠原酸、莨菪葶、蕓香苷，其比例與烤煙煙葉中游離態多酚比例相似[10]。

以不同濃度的標樣進行外標標準曲線測定，外標標準曲線方程分別為綠原酸y=3×10-5x（R2=0.992 1）、莨菪葶y=1×10-5x（R2=0.995）、蕓香苷y= 4×10-5x（R2=0.991 3），通過方程得到綠原酸濃度為0.014 0 mg/mL，莨菪葶濃度為0.003 3 mg/mL，蕓香苷濃度為0.019 0 mg/mL，從而計算出蛋白質-多酚復合物中多酚含量分別為2.1、0.5、2.9 mg/g。

2.3 蛋白質-多酚復合物的抗氧化能力

2.3.1 蛋白質-多酚復合物對DPPH·自由基的清除能力 對于不同蛋白質-多酚復合物濃度及不同水解程度進行DPPH·自由基清除試驗，樣品稀釋為蛋白質濃度3.5、4.4、5.8、8.8、17.5、35.0、70.0、116.7、175.0 μg/mL。從圖3可以看出，蛋白質-多酚復合物在較低濃度時就可清除DPPH·自由基，在3.5～35.0 μg/mL，蛋白質-多酚復合物對DPPH·自由基的清除效率與蛋白質-多酚復合物濃度呈劑量-效應關系，也就是隨著低次煙葉蛋白質-多酚復合物濃度的增加，對DPPH·自由基的清除率增大（P<0.05），當濃度為35.0 μg/mL時，蛋白質-多酚復合物對DPPH·自由基的清除率達到89.7%，之后隨著蛋白質-多酚復合物濃度的增加，對DPPH·自由基的清除率增加不顯著（P>0.05）。

用蛋白酶對蛋白質-多酚復合物進行酶解，其對DPPH·自由基的清除效果如圖4所示。隨著酶解時間的延長，蛋白質-多酚復合物中蛋白質的水解程度越高，對DPPH·自由基的清除活性呈下降趨勢（P<0.05）。蛋白酶的水解作用僅僅是針對蛋白質中的肽鍵，而對其功能基團不會破壞，水解后蛋白質-多酚復合物活性的降低表明其抗氧化活性來源并不是蛋白質。結合對蛋白質-多酚復合物中多酚的檢測，可以推斷蛋白質-多酚復合物的強抗氧化活性可能來源于多酚的作用[12]，而其結合形式為非共價結合[13]。蛋白質的水解使其與多酚的結合被破壞，失去蛋白質的結合后多酚的抗氧化活性不宜保持，從而導致了復合物抗氧化活性的下降。

2.3.2 蛋白質-多酚復合物對OH·自由基的清除能力 對不同蛋白質-多酚復合物濃度及不同水解程度進行OH·自由基清除試驗，將樣品稀釋為蛋白濃度分別為3.5、4.4、5.8、8.8、17.5、35.0、43.8、58.5、87.5、175.0、350.0、700.0 μg/mL，樣品蛋白質-多酚復合物中蛋白濃度與清除羥基自由基的能力如圖5所示。與蛋白質-多酚復合物清除DPPH·自由基的清除效果相似，在較低濃度時，蛋白質-多酚復合物就可清除羥基自由基，在4.4～175.0 μg/mL時，隨著蛋白質-多酚復合物濃度的升高，對羥基自由基的清除率也升高（P<0.05），當蛋白質-多酚復合物中蛋白質濃度為175.0 μg/mL時，對羥基自由基的清除率為79.55%，之后隨著蛋白質-多酚復合物濃度的增加，對羥基自由基的清除率增加不顯著（P>0.05）。

采用蛋白酶酶解蛋白質-多酚復合物，隨著酶解時間的延長，蛋白質-多酚復合物中蛋白質水解程度增大，對OH·自由基的清除率呈下降趨勢（P<0.05）（圖6）。這與之前對DPPH·自由基的清除結果相似，也進一步證明蛋白復合物中含有多酚，可能與其非共價結合，這種結合態使得多酚更加穩定，使蛋白質-多酚復合物具有抗氧化性，在蛋白質被水解后，這種復合物被破壞，從而導致蛋白質-多酚復合物抗氧化性降低。

3 小結

堿溶酸沉法提取低次煙葉中蛋白質-多酚復合物，對其進行成分分析，其蛋白質含量為350 mg/g，多酚中綠原酸2.1 mg/g，莨菪葶0.5 mg/g，蕓香苷2.9 mg/g。對其進行抗氧化性檢測，結果表明，其抗氧化活性隨著蛋白質-多酚復合物濃度增大而增大，蛋白質酶解后隨著酶解時間的增加抗氧化活性降低，表明蛋白質-多酚復合物中抗氧化活性可能主要來源于與其非共價結合的多酚，且在結合的狀態下才能保持蛋白復合物的抗氧化活性。

參考文獻：

[1] 楊 亞，朱列書，馮連軍，等.從硒對人類健康的作用看煙草硒蛋白的發展前景[J].作物研究，2009（5）：355-359.

[2] KUNG S D，SAUNDERS J A，TSO T C，et al. Tobacco as a potential food source and smoke material：Nutritional evaluation of tabacco leaf protein[J].Beitr Tabakaforsch Int，1980，45（2）：320-322.

[3] LOWE R H. Crystallization of fraction I protein of tobacco by a simplified procedure[J].FEBS Letter，1977，78：98-100.

[4] 趙謀明，饒國華，林偉鋒，等.低次煙葉中蛋白質提取工藝優化及氨基酸分析研究[J].農業工程學報，2006（1）：142-146.

[5] 林曉婕，傅 紅，楊 琳，等.煙草色素蛋白復合物中多酚類物質對其抗紫外性能的影響[J].中國煙草科學，2011（2）：57-61.

[6] 王 潔.多酚-蛋白質相互作用的影響因素及其功能特性研究進展[J].河南工業大學學報（自然科學版），2012（3）：91-96.

[7] 張 恒.幾種糧食類植物蛋白分離方法[J].糧食科技與經濟，1997（4）：40-42.

[8] BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem，1976，72：248-254.

[9] YC/T 202-2006，煙草及煙草制品多酚類化合物綠原酸、莨菪葶和蕓香苷的測定[S].

[10] 勾明玥，劉 梁，張春枝.采用DPPH法測定26種植物的抗氧化活性[J].食品與發酵工業，2010（3）：148-150.

[11] 付林林，郭玉華.六種中藥抗羥自由基活性研究[J].安陽工學院學報，2010（4）：26-27.

[12] 闞茗銘，葉發銀，趙國華.多酚-蛋白質共價作用及其對食品體系的影響研究進展[J].食品科學，2015（1）：245-249.

[13] 張 曼，王岸娜，吳立根，等.蛋白質、多糖和多酚間相互作用及研究方法[J].糧食與油脂，2015（4）：42-46.