瓠瓜類型砧木遺傳作圖群體雙親多態性分析

宋慧+王毓洪+張香琴

摘要：以耐濕澇瓠瓜類型砧木材料JZS與不耐濕澇材料T2002為遺傳作圖雙親，利用隨機擴增多態性DNA（random amplification polymorphic DNA，簡稱RAPD）法與瓠瓜及其他近源瓜類簡單重復序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）進行多態性分析。從供試1 678個RAPD、SSR標記中共篩選到26個多態性引物，其中包括14個RAPD、4個瓠瓜SSR、2個甜瓜SSR、5個黃瓜SSR、1個南瓜SSR，擴增出28個多態性位點。幾種標記多態性檢測效率不同，瓠瓜SSR引物揭示，雙親多態性比例最高（0.47%），其次是RAPD（0.38%），近源瓜類SSR選擇效率最低，僅有0.14%～0.15%。結果表明，盡管瓠瓜作圖親本表型差異大，但分子標記結果顯示親本遺傳背景相近；甜瓜、黃瓜和南瓜與瓠瓜親緣關系遠，具有種屬特異性的SSR引物在瓠瓜親本JZS、T2002多態性分析中通用性不高。為了提高分子標記多態性分析效率，繪制高密度遺傳圖譜，下一步應盡快開展基于基因組測序技術檢測單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，簡稱SNP）位點的研究。

關鍵詞：瓠瓜；砧木；多態性分析；耐濕澇

中圖分類號： S184 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0048-03

我國約有2/3的國土面積存在不同程度的濕澇脅迫，嚴重影響黃瓜、西瓜和甜瓜等瓜類作物種植生產[1]。瓠瓜[Lagenaria siceraria （Molina） Standl.]根部發達，用作瓜類嫁接砧木，能夠增強接穗耐逆性，提高產量[2]。耐濕澇瓠瓜砧木的選育已成為瓠瓜育種的重要目標之一。

瓠瓜耐濕澇特性是由多基因控制的數量遺傳性狀[3]。前期筆者通過集團混合分離分析法（bulked segregation analysis，簡稱BSA），以不定根數作為鑒定指標，篩選到簡單重復序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）引物S87/88與瓠瓜耐濕澇性狀相關性為0.78，這與瓠瓜耐濕澇特性目的基因尚存在較大遺傳距離[4]，影響分子輔助選擇的正確性，亟須通過遺傳圖譜構建和耐濕澇數量性狀基因座（quantitative trait locus，簡稱QTL）定位等手段為瓠瓜耐濕澇分子育種提供緊密連鎖分子標記。

SSR引物具有種屬特異性，瓠瓜基因組研究相對于黃瓜、西瓜和甜瓜等瓜類作物相對薄弱，僅有浙江省農業科學院李國景研究員所在課題組的相關報道[5]，瓠瓜SSR開發數目有限。為此，筆者所在課題組利用隨機擴增多態性DNA（random amplification polymorphic DNA，簡稱RAPD）、瓠瓜SSR及其他近源瓜類SSR，對瓠瓜類型砧木遺傳作圖雙親（耐濕澇材料JZS與不耐濕澇材料T2002）進行多態性分子標記分析，以期為瓠瓜遺傳圖譜構建和耐濕澇QTL定位研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用材料為瓠瓜類型砧木耐濕澇材料JZS、不耐濕澇材料T2002及其F1代。將種子播種于32孔穴盤中，按常規方法進行田間管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 材料播種后，待植株長至5～6張真葉時，每份樣品各取10張單株的混合葉片，每株采集1 g嫩葉，于-80 ℃保存。參照CTAB法，提取新鮮葉片總基因組DNA。

1.2.2 分子標記分析 甜瓜SSR引物序列由美國威斯康星大學園藝系翁益群教授提供，瓠瓜SSR引物序列由浙江省農業科學院蔬菜研究所李國景研究員提供。RAPD、SSR的混樣體系為20μL，包括3.24 μL dNTP（1.25 mmol/L）、1.5 μL 10×buffer、2.43 μL MgCl2（25 mmol/L）、1.35 μL引物（5 mmol/L）、5 μL DNA（10 ng/μL）、0.05 μL Taq DNA聚合酶（1 U）。RAPD、SSR的PCR產物分別用2%瓊脂糖凝膠和高分辨率MS-6瓊脂糖凝膠（TaKaRa，上海）水平電泳檢測。

1.3 數據記錄與連鎖分析

根據相同遷移率位置表現出的差異帶型，確定在雙親中顯示差異的分子標記，用于多態性分析。

2 結果與分析

2.1 RAPD引物在雙親中的擴增和多態性篩選

600對RAPD引物分別在雙親JZS、T2002中擴增出4 188、4 197個條帶，平均每個引物產生6.99個條帶（表1）。篩選到14個RAPD引物（分別編號為P21、P38、P77、P79、P80、P86、P184、P214、P237、P284、P289、P366、P421、P589），共擴增出16個多態性位點（圖1）。RAPD引物揭示雙親的多態性比例為0.38%。

2.2 瓠瓜SSR在雙親中的擴增和多態性篩選

100對瓠瓜SSR引物分別在雙親JZS、T2002中擴增出852、854個條帶，平均每個引物產生8.53個條帶（表1）。篩選到4對引物（分別為S35/36、S45/46、S49/50、S87/88），共擴增出4個多態性位點（圖2）。瓠瓜SSR引物擴增結果顯示，親本材料的多態性比例為0.47%，高于RAPD揭示的多態性比例（0.38%）。

2.3 甜瓜SSR、黃瓜SSR和南瓜SSR在雙親中的擴增和多態性篩選

分別使用251對甜瓜SSR、595對黃瓜SSR和132對南瓜SSR對雙親JZS、T2002進行擴增，結果篩選到2對甜瓜SSR（T35/36、T193/194）、5對黃瓜SSR（H37/38、H41/42、H49/50、H61/62、H241/242）和1對南瓜SSR（N15/16）（圖3），3種SSR引物揭示雙親多態性比例分別為0.14%、0.15%、0.14%，低于RAPD引物（0.38%）、瓠瓜SSR（0.47%）揭示的多態性比例。

3 討論

作物耐濕澇特性是較為復雜的數量性狀，國內外有關耐濕澇的研究多集中在小麥[6]、大麥[7]、玉米[8]等大田經濟作物，葫蘆科作物中除了模式作物黃瓜有少量報道[9]以外，鮮有報道提及其他瓜類作物的耐濕澇研究。瓠瓜根系發達，耐濕澇特性突出，是瓜類作物耐濕澇性狀改良的重要基因庫。盡管眾多葫蘆科作物很早就被用來開展利用分子遺傳圖譜定位重要農藝性狀的研究[10-11]，但是針對瓠瓜耐濕澇特性QTL定位的研究未見開展，從而制約了進一步利用分子手段改良瓜類作物耐濕澇特性的研究進程。

瓠瓜表型變異大，但從分子標記研究結果來看，瓠瓜遺傳背景狹窄。在本研究中，幾種標記多態性檢測效率不同，瓠瓜SSR、RAPD揭示耐濕澇親本JZS和不耐濕澇親本T2002的多態性比例分別只有0.47%、0.38%，而選用的近源瓜類SSR選擇效率更低，多態性比例僅為0.14%～0.15%，一方面表明作圖親本JZS和T2002親緣關系近，另一方面表明甜瓜、黃瓜、南瓜與瓠瓜親緣關系遠，基于種屬特異性的SSR引物在JZS、T2002多態性分析中通用性不高。

Neuhausen認為，葫蘆科作物的基因組變化主要源于點突變[12]，因此RAPD、SSR這類基于擴增片段多態性的分子標記能夠檢測的多態性較低，有必要進一步開展基于測序技術檢測單核苷酸多態性位點（SNP）的多態性研究，提高分子標記分辨率，為繪制高密度遺傳圖譜奠定良好基礎。

參考文獻：

[1]陳嶸峰. 黃瓜品種資源的耐澇性鑒定及耐澇相關性狀QTL的初步定位[D]. 揚州：揚州大學，2009：15-19.

[2]Davis A R，Perkins-Veazie P，Sakata Y，et al. Cucurbit grafting[J]. Critical Reviews in Plant Sciences，2008，27（1）：50-74.

[3]張艷欣，王林海，黎冬華，等. 芝麻耐濕性QTL定位及優異耐濕基因資源挖掘[J]. 中國農業科學，2014，47（3）：422-430.

[4]宋 慧，張香琴，高 旭，等. 瓠瓜耐濕澇相關根系性狀遺傳規律及分子標記篩選[J]. 華北農學報，2013，28（4）：62-65.

[5]Xu P，Wu X H，Luo J，et al. Partial sequencing of the bottle gourd genome reveals markers useful for phylogenetic analysis and breeding[J]. BMC Genomics，2011，12（1）：467-477.

[6]Yu M，Chen G Y. Conditional QTL mapping for waterlogging tolerance in two RILs populations of wheat[J]. Springer Plus，2013，2（1）：245.

[7]欒海業. 大麥苗期耐濕性遺傳分析與QTL定位[D]. 揚州：揚州大學，2011：25-28.

[8]Qiu F Z，Zheng Y L，Zhang Z L，et al. Mapping of QTL associated with waterlogging tolerance during the seedling stage in maize[J]. Annals of Botany，2007，99：1067-1081.

[9]Yeboah M A，Chen X，Feng C R，et al. Genetic component analysis of waterlogging tolerance in cucumber[J]. Indian Journal of Horticulture，2008，65（3）：280-284.

[10]范 敏，許 勇，張海英，等. 西瓜果實性狀QTL定位及其遺傳效應分析[J]. 遺傳學報，2000，27（10）：902-910.

[11]羊杏平，劉 廣，侯喜林，等. 利用RAPD和ISSR分子標記對西瓜作圖親本的多態性分析[J]. 江蘇農業學報，2009，25（5）：1100-1107.

[12]Neuhausen S L. Evaluation of restriction fragment length polymorphism in Cucumis melo[J]. Theoretical and Applied Genetics，1992，83（3）：379-384.