不對稱PCR的引物濃度優化及在柑橘基因型分析上的應用

魏召新+朱世平+陽佳位

摘要：對柑橘不對稱PCR的引物比例濃度進行優化篩選，并以不同柑橘品種的基因組片段為模板驗證不對稱PCR在柑橘品種基因型分析中的可行性。結果表明，不對稱PCR雙側的引物最佳濃度因引物不同而不同，當濃度為10 ∶1時均能達到理想效果，可見不對稱PCR可以用于柑橘基因型分析。

關鍵詞：不對稱PCR；單鏈構象多態性；柑橘；引物濃度比；基因型分析

中圖分類號： S666.201 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0046-02

不對稱PCR利用不等量的一對引物進行PCR擴增，產生單鏈產物（ssDNA），這對引物分別稱為非限制性引物與限制性引物。在PCR反應的最初10～15個循環中，其擴增產物主要是雙鏈DNA（dsDNA），但當限制性引物消耗完后，非限制性引物引導的PCR就會產生大量的單鏈產物。不對稱PCR作為一個基礎試驗技術，方法簡單、成本低廉、用途廣泛，用于制備單鏈模板以用于雙脫氧測序[1]，用于cDNA擴增以研究真核生物的DNA外顯子[2]，用于單鏈探針制備[3]，還可與酶聯免疫法結合檢測柑橘CTV病毒[4]，甚至結合毛細管電泳技術對人進行疾病診斷[5]。

不對稱PCR制備ssDNA須多次摸索優化2條引物的比例。常規不對稱PCR是利用單側引物進行一次PCR，然后進行電泳檢測，這種方法要消耗大量的DNA模板。而二次PCR是先用等濃度的引物PCR擴增制備dsDNA，然后以此dsDNA為模板，再以其中的一條引物進行第2次PCR，制備ssDNA，大大減少模板的消耗量，產生的dsDNA與ssDNA由于分子量不同可以在電泳中分開，并可利用單鏈構象多態性鑒別不同樣品之間的差異。

利用不對稱PCR進行基因差異分析，不僅具有PCR-SSCP研究單核苷酸多態性（SNP）的功能，而且簡化了操作步驟，提高了工作效率。柑橘資源豐富、品種繁多、種屬間易于雜交、芽變材料多、基因組大（約367 Mbp）[6]，隨著甜橙[7]和單倍體克里曼丁橘[8]成功測序推動，SNP研究必將得到進一步拓展和深化，盡管有利用不對稱PCR對基因突變效率進行檢測的報道[9]，但利用SNP應用于柑橘基因研究方面還比較少，因此本試驗對不對稱PCR體系中上下游引物濃度比進行優化，并以柑橘為材料進行基因型研究的可行性。

1 材料與方法

根據柑橘的基因序列設計3對引物，產物片段長度在 100～300 bp。采用二次PCR方式，均采用25 μL體系，ddH2O 18.35 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTPs（25 mmol/L）1.0 μL，MgCl2 1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，rTaq 0.15 μL，模板1.0 μL。引物M1源于Unigen Cit.47.1，上游引物為5′-CCGAGAAAACGCAAAAGCTA-3′，下游引物為5′-TTGTACTCGAGCAGCGACAC-3′。引物M2源于Unigen Cit.107.1，上游引物為5′-CCCTGAGACGAAGAACAAGG-3′，下游引物為5′-CTGGCAAGCAACTGGAAGAC-3′。引物M3源于Unigen Cit.10080.1，上游引物為5′-ACCATGACCGCTGAGGAATA-3′，下游引物為5′-GGAAAACAGGGCAACTTCAG-3′。其中，第2次PCR引物對在一側引物保持原濃度的條件下，另一側引物按比例稀釋，模板以第1次PCR產物稀釋100～200倍后，各組分均按第1次PCR體系體積加入反應體系。

PCR反應條件沿用前期優化過的PCR反應條件：95 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 30 s，33 個循環；最后72 ℃ 延伸10 min 。取3 μL擴增產物，加6 μL 98%去離子甲酰胺，10 mmol/L EDTA（pH值8.0），0.25% 二甲苯青，0.25%溴酚藍變性劑混勻，上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），10 ℃ 110 V條件下電泳5 h，銀染顯色。

2 結果與分析

2.1 不對稱PCR引物濃度比優化

以特洛維塔甜橙的DNA為模板，采用M1和M2引物對進行引物不同濃度的不對稱PCR比較，電泳結果見圖1和圖2。圖1和圖2中各對應的泳道其產物PCR條件和電泳條件均相同，唯一不同的是引物，電泳后的效果差異明顯，圖1中上下游引物從40 ∶1時產物帶開始明顯不清晰，但圖2中的單雙鏈產物始終存在。

由圖1的電泳結果可見，隨著單側引物濃度的降低，雙鏈產物和單鏈產物也逐漸減少，上下游引物比例在10 ∶1時，單鏈產物量未明顯降低，不影響產物電泳及顯色觀察；上下游引物比例變為20 ∶1時，單鏈產物量明顯減少。此外，在上下游引物濃度比為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20和1 ∶40時，帶型明顯不能對應正常PCR-SSCP的帶型，而引物相反濃度的電泳結果正確對應正常PCR-SSCP的帶型，這說明下游引物所產生的單鏈之間形成了多種構象。

由圖2的電泳結果可見，M2引物對不同濃度比例的優化結果有所不同，隨著單側引物濃度的增加，雙鏈產物也逐漸增加，但單鏈產物量增加不明顯。此外，在上下游引物濃度比例為80 ∶1、60 ∶1、40 ∶1和20 ∶1的電泳圖中，可見一特殊條帶（圖2中箭頭所示），此條帶僅在下游引物中出現，在相反的上下游引物濃度比中未出現，并且不能對應到正常PCR-SSCP的帶型，這應該是下游引物產生的單鏈之間形成的二級結構。

2.2 不同模板的不對稱PCR驗證

由圖3中電泳結果可見，以模板1、2、3、4進行不對稱PCR所得產物帶型因模板不同而相同。同一個模板，因上下游引物濃度比例不同也會產生不同的帶型，通過比較上下游引物不對稱PCR的帶型和常規PCR-SSCP的帶型，可以推斷帶型的來源。反之，可以以不對稱產物帶型的不同推斷產物之間存在差異，以此鑒別產物的差異，也可以判斷不同材料的基因型以進行聚類分析。

圖3中1、2、3和4由左至右依次是以不同的柑橘品種特洛維塔、圓金柑、長壽金柑和紅河大翼橙為模板，利用M3引物對按上下游引物1 ∶1常規PCR-SSCP、10 ∶1和1 ∶10進行二次不對稱PCR的結果。

3 結論與討論

本試驗通過不對稱PCR研究單側引物在雙鏈模板上延伸的合理條件，同時探索利用該方法進行基因型鑒定的可行性。以上試驗結果表明，不對稱PCR可以用于單鏈產物擴增，也可以用于部分柑橘品種區分、等位基因分析及目標片段的基因型鑒定。

不對稱PCR反應擴增長度有限，在多次試驗中，目標片段長度在500 bp以上的結果均不理想，因此利用普通Taq酶進行不對稱PCR時，所擴增的目的片段長度不宜過長，一般宜控制在500 bp以下。而研究長片段時，宜改用或改進試驗方法，Sofia等在研究歐洲栗內切β-1，3-葡聚糖酶基因的一段片段（1 231 bp）時，就改用了不對稱巢式PCR技術，采用多個引物進行研究[10]。此外，用其他方法可以對引物進行常規預擴增，產物經PAGE檢測目標雙鏈僅1條帶，無雜帶干擾，以獲得帶型簡單易于分析的結果。從本試驗結果比較可見，不同引物的PCR效率是不同的，甚至模板也能影響引物的擴增效率，因此必要時可以對引物進行初步篩選或結合其他方式進一步分析，Gruz等利用不對稱PCR技術結合熔解曲線分析能夠對單核苷酸多態性進行高通量的基因分型[11]。

常規的PCR條件下，不對稱PCR所使用的引物的量不同，一次PCR所獲得單鏈產物較少，要獲得更多單鏈產物，模板濃度應足夠大，或進行二次PCR。盡管曾鴻普等一次不對稱PCR就得到了較為清晰的結果[12]，但在試驗過程中發現，第1次PCR產物稀釋100～200倍后作為二次PCR的模板進行不對稱PCR，不僅大大減少了模板用量，而且帶型清晰、易于分析，結果更為理想。

單側引物濃度不變，另一側引物稀釋為原濃度的1/10后進行不對稱PCR，目標雙鏈和單鏈產物帶清晰，濃度比例較為適當，也說明二次不對稱PCR同時使用上下游引物更容易獲得高濃度的dsDNA。此外，本試驗結果表明單鏈產物在利用單鏈構象多態性進行凝膠檢測時，單鏈在凝膠上所體現的形式因單鏈產物及其自身所形成的構象不同而可能有多種，因此基于SSCP的產物檢測應注意在相同條件下進行多重比較，以避免誤判，方能獲得更為可靠的分析結果。

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