胸腺瘤中E-cadherin、β-catenin蛋白和基因的表達(dá)

黃 波，徐詠強(qiáng)，梁遠(yuǎn)秋

胸腺瘤(thymoma)是一種呈惰性生長(zhǎng)并且具有潛在惡性的胸腺上皮源性腫瘤，既有非常復(fù)雜的鏡下結(jié)構(gòu)，又存在病理與預(yù)后之間的矛盾，其發(fā)生機(jī)制目前仍不清楚。

上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)機(jī)制和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路是目前腫瘤研究的焦點(diǎn)。大量研究顯示在乳腺癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤的侵襲過(guò)程中均伴有腫瘤細(xì)胞的EMT現(xiàn)象和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的改變。胸腺瘤是一種生物學(xué)行為非常復(fù)雜的腫瘤，目前研究認(rèn)為30%～40%的胸腺瘤具有侵襲性。β-catenin基因定位于3q21.3，是Wnt信號(hào)通路中的重要調(diào)節(jié)因子，若其在細(xì)胞中出現(xiàn)異常積聚，則可導(dǎo)致腫瘤具有侵襲性[1-2]。E-cadherin是介導(dǎo)細(xì)胞間黏附的重要細(xì)胞因子，其低表達(dá)或者不表達(dá)被認(rèn)為是EMT過(guò)程的標(biāo)志，亦可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。E-cadherin與β-catenin結(jié)合形成E-cadherin-catenins復(fù)合體，其結(jié)構(gòu)和功能的異常與許多腫瘤的侵襲密切相關(guān)。本組實(shí)驗(yàn)聯(lián)合免疫組化和熒光原位雜交檢測(cè)，旨在探討E-cadherin和β-catenin蛋白及基因的表達(dá)與胸腺瘤侵襲性的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1材料選取2012年～2016年?yáng)|莞市人民醫(yī)院存檔的胸腺瘤手術(shù)標(biāo)本，即往診斷為A型、AB型、B1型、B2型、B3型及C型胸腺瘤的病例共120例。

1.2方法根據(jù)WHO(2015)胸腺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)及Masaoka臨床分期方法、組織形態(tài)學(xué)特征、免疫組化標(biāo)記、臨床特點(diǎn)和影像資料，對(duì)120例胸腺瘤按無(wú)侵襲性和有侵襲性分組，并對(duì)各組分別行E-cadherin和β-catenin蛋白免疫組化染色(SP法)及E-cadherin和β-catenin基因熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)。E-cadherin和β-catenin抗體免疫組化檢測(cè)設(shè)立PBS液代替一抗作陰性對(duì)照，以試劑盒內(nèi)已知的陽(yáng)性對(duì)照片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3結(jié)果判定

1.3.1免疫組化染色結(jié)果半定量分析 E-cadherin蛋白主要定位于細(xì)胞膜，即細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒視為E-cadherin蛋白陽(yáng)性。β-catenin蛋白則以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽(yáng)性標(biāo)志，一般從胞膜、胞質(zhì)和胞核三方面綜合判斷β-catenin蛋白在胞內(nèi)的分布情況：胞膜>70%的細(xì)胞出現(xiàn)陽(yáng)性則視為正常表達(dá)，反之<70%則視為膜表達(dá)缺失；胞質(zhì)、胞核>10%的細(xì)胞陽(yáng)性視為胞質(zhì)、胞核陽(yáng)性表達(dá)，胞質(zhì)、胞核陽(yáng)性表達(dá)常稱作異位表達(dá)，胞膜表達(dá)缺失及胞質(zhì)、胞核表達(dá)均為異常表達(dá)。一般胞膜正常表達(dá)判為陰性，異常表達(dá)判為陽(yáng)性。兩者均以陽(yáng)性細(xì)胞百分比結(jié)合染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合計(jì)分。(1)染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。(2)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0分為陰性(-)，1～4為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為中度陽(yáng)性(2+)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(3+)。

1.3.2FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀 E-cadherin基因結(jié)果判定：(1)閾值設(shè)定：隨機(jī)選取10例以上陰性對(duì)照樣本作為陰性質(zhì)控片，每張陰性質(zhì)控片隨機(jī)計(jì)數(shù)至少100個(gè)細(xì)胞，分別計(jì)算出各類型FISH陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目及百分比，同時(shí)統(tǒng)計(jì)出百分比的標(biāo)準(zhǔn)差和平均值，陰性閾值則設(shè)為平均值+3倍的標(biāo)準(zhǔn)差。(2)計(jì)數(shù)方法：計(jì)數(shù)至少100個(gè)細(xì)胞，出現(xiàn)2R2G信號(hào)類型的細(xì)胞記為FISH陰性細(xì)胞；出現(xiàn)nR2G(n≤1)信號(hào)類型的細(xì)胞記為FISH陽(yáng)性細(xì)胞。①若出現(xiàn)FISH陽(yáng)性細(xì)胞的比例大于陰性閾值時(shí)，判斷為FISH陽(yáng)性；②若出現(xiàn)FISH陽(yáng)性細(xì)胞的比例小于陰性閾值時(shí)，判斷為FISH陰性；③如果FISH陽(yáng)性的細(xì)胞比例與陰性閾值相等，則需加大計(jì)數(shù)的數(shù)目或者分析整張切片，如果仍然比陰性閾值小，則判為FISH陰性；否則視為FISH陽(yáng)性。

β-catenin基因結(jié)果判定：β-catenin基因的探針采用綠色標(biāo)記，正常細(xì)胞胞核中綠色的點(diǎn)為2個(gè)，當(dāng)綠色點(diǎn)>2個(gè)時(shí)，說(shuō)明該基因有擴(kuò)增。高倍鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞核，其中標(biāo)記基因信號(hào)數(shù)≥3的細(xì)胞核數(shù)目>40個(gè)，記為該病例擴(kuò)增；11～40個(gè)之間記為臨界擴(kuò)增；0～10個(gè)之間則記為無(wú)擴(kuò)增。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)組織中E-cadherin和β-catenin蛋白和基因的表達(dá)水平在無(wú)侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中行χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1鏡檢無(wú)侵襲性胸腺瘤大多為A、AB和B1型(圖1)。A型胸腺瘤幾乎無(wú)淋巴細(xì)胞，瘤細(xì)胞表現(xiàn)為卵圓形或梭形，且細(xì)胞核仁不明顯，腫瘤細(xì)胞呈實(shí)性片塊狀或車輻狀排列。AB型胸腺瘤組織學(xué)上呈彌散分布的結(jié)節(jié)狀，通常由淋巴細(xì)胞少的A型以及富含淋巴細(xì)胞的B型胸腺瘤混合而成。在A型成分區(qū)可見到所有A型胸腺瘤的特征，而B型成分區(qū)則是獨(dú)特的。B型成分區(qū)瘤細(xì)胞通常由小多角形上皮細(xì)胞組成，核小而圓。B1型胸腺瘤上皮細(xì)胞小且少，異型性通常不明顯，周圍可見非腫瘤性的T淋巴細(xì)胞環(huán)繞，可見胸腺小體。侵襲性胸腺瘤大多為B2、B3及C型(圖2)。B2胸腺瘤呈纖細(xì)分隔的粗大小葉，部分類似于正常胸腺皮質(zhì)小葉結(jié)構(gòu)，呈多角形，胞核大，染色質(zhì)較稀疏，可見明顯的中位核仁。B3及C型胸腺瘤在組織學(xué)上腫瘤細(xì)胞呈小葉狀，通常由較厚的纖維及透明樣變的間隔分隔開，上皮內(nèi)的淋巴細(xì)胞稀少，瘤細(xì)胞形成表皮樣結(jié)構(gòu)或者呈模糊的實(shí)性片狀。

2.2E-cadherin和β-catenin蛋白在胸腺瘤中的表達(dá)E-cadherin蛋白在無(wú)侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中的陽(yáng)性率分別為87.69%(57/65)和58.18%(32/55)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。β-catenin蛋白在無(wú)侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中的陽(yáng)性率分別為12.31%(8/65)和43.64%(24/55)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1，圖3～6)。

表1 E-cadherin、β-catenin蛋白在有侵襲性和無(wú)侵襲性胸腺瘤中的表達(dá)

2.3E-cadherin及β-catenin基因表達(dá)E-cadherin基因在無(wú)侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中表達(dá)下調(diào)或缺失分別為15.38%(10/65)和56.36%(31/55)，統(tǒng)計(jì)分析顯示，E-cadherin基因在無(wú)侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。β-catenin基因在無(wú)侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中的表達(dá)擴(kuò)增率分別為26.15%(17/65)和58.18%(32/55)，統(tǒng)計(jì)分析顯示，β-catenin基因在無(wú)侵襲性和有侵襲性胸腺瘤中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2，圖7、8)。

表2 E-cadherin、β-catenin基因在有侵襲性和無(wú)侵襲性胸腺瘤中的表達(dá)

3 討論

本組120例胸腺瘤，按照WHO(2015)胸腺腫瘤新分類標(biāo)準(zhǔn)，綜合胸腺瘤鏡下特點(diǎn)、免疫標(biāo)記、Masaoka臨床分期標(biāo)準(zhǔn)、臨床表現(xiàn)、影像資料以及相關(guān)文獻(xiàn)將其分類，其中侵襲性胸腺瘤55例，無(wú)侵襲性胸腺瘤65例。胸腺瘤患者的預(yù)后水平與腫瘤是否發(fā)生侵襲關(guān)系密切，大量研究表明，有侵襲性的胸腺瘤患者預(yù)后水平明顯比無(wú)侵襲性的胸腺瘤患者差，無(wú)侵襲性的胸腺瘤患者5年和10年生存率分別為75%和63%，而有侵襲性胸腺瘤患者的5年和10年生存率分別為50%和30%[3-5]。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合免疫組化及熒光原位雜交技術(shù)分別檢測(cè)E-cadherin、β-catenin蛋白和基因的表達(dá)，以期為有侵襲性和無(wú)侵襲性胸腺瘤的診斷和鑒別診斷提供有效的生物學(xué)指標(biāo)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，E-cadherin、β-catenin蛋白和基因的表達(dá)與胸腺瘤的侵襲性有顯著相關(guān)性。

①②③④⑤⑥⑦⑧

圖1無(wú)侵襲性胸腺瘤(AB型)：腫物由淋巴細(xì)胞較少的A型成分及富于淋巴細(xì)胞的B型成分構(gòu)成，A型成分細(xì)胞呈梭形，B型成分細(xì)胞呈小多角形，核較小，圓形或卵圓形，核仁不明顯圖2有侵襲性胸腺瘤(B3型)：由呈巢片狀生長(zhǎng)的上皮樣細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞混合增生構(gòu)成，上皮樣細(xì)胞核呈空泡狀，核仁明顯圖3無(wú)侵襲性胸腺瘤中E-cadherin蛋白陽(yáng)性，SP法圖4有侵襲性胸腺瘤中E-cadherin蛋白陽(yáng)性，SP法圖5無(wú)侵襲性胸腺瘤中β-catenin蛋白陽(yáng)性，SP法圖6有侵襲性胸腺瘤中β-catenin蛋白陽(yáng)性，SP法圖7有侵襲性胸腺瘤組織中E-cadherin基因陽(yáng)性，F(xiàn)ISH圖8有侵襲性胸腺瘤組織β-catenin基因擴(kuò)增，F(xiàn)ISH

近年隨著分子遺傳學(xué)研究在胸腺瘤分類和鑒別診斷方面的不斷應(yīng)用，使得分子生物學(xué)在胸腺瘤的診斷及鑒別診斷方面的地位日益突顯[6]。相關(guān)研究證實(shí)，E-cadherin基因低表達(dá)或不表達(dá)及β-catenin基因高拷貝數(shù)擴(kuò)增表達(dá)可促進(jìn)多種腫瘤的侵襲。E-cadherin和β-catenin兩種蛋白在胸腺瘤中的表達(dá)已有相關(guān)報(bào)道，然而這兩種基因在胸腺瘤中的表達(dá)情況則尚未見相關(guān)報(bào)道。

E-cadherin作為一種鈣依賴性細(xì)胞跨膜糖蛋白，近年來(lái)隨著研究的不斷深入，E-cadherin已成為探討瘤細(xì)胞侵襲性的熱點(diǎn)。E-cadherin是一種抑癌基因，位于人類16號(hào)染色體長(zhǎng)臂16q22.1，其編碼的氨基酸有723～748個(gè)[7]。E-cadherin幾乎在所有上皮組織中呈不同程度的表達(dá)，在細(xì)胞之間的連接中起關(guān)鍵性作用，其能夠影響腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的黏附，因此其表達(dá)水平下降將導(dǎo)致腫瘤的侵襲，從而影響患者預(yù)后[8-9]。如今，E-cadherin抑制癌細(xì)胞侵襲這一觀點(diǎn)已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可[10-11]。E-cadherin表達(dá)異常可通過(guò)多種機(jī)制來(lái)促使腫瘤發(fā)生侵襲[12-13]：(1)E-cadherin表達(dá)異常將降低瘤細(xì)胞之間的黏附能力，使得腫瘤細(xì)胞脫離瘤體而發(fā)生侵襲；(2)E-cadherin表達(dá)異常可以促進(jìn)人體基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌和基質(zhì)降解，加快細(xì)胞的侵襲；(3)脫離瘤體的細(xì)胞無(wú)接觸抑制作用，將不再與相鄰細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)因子，因此得到的生長(zhǎng)刺激信號(hào)將會(huì)更多；(4)瘤細(xì)胞與瘤體分離后發(fā)生侵襲能夠得到更多營(yíng)養(yǎng)。

胸腺瘤的發(fā)生、發(fā)展是多因素參與的復(fù)雜過(guò)程。近年來(lái)，隨著分子遺傳學(xué)及分子生物學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展以及檢測(cè)方法的日新月異，發(fā)現(xiàn)很多與胸腺瘤發(fā)病相關(guān)的基因，這對(duì)于我們更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)胸腺瘤的發(fā)病機(jī)制、界定胸腺瘤的組織分型和分級(jí)、對(duì)患者進(jìn)行生物治療以及判斷患者預(yù)后提供新方向。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，E-cadherin基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度比在正常細(xì)胞中低，并且E-cadherin基因的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)E-cadherin基因時(shí)采取了紅綠雙探針，以此來(lái)做內(nèi)對(duì)照，即紅色探針是本組的目的基因，綠色探針是對(duì)照基因，且綠色對(duì)照基因位于紅色目的基因的隔壁。當(dāng)綠色信號(hào)正常而紅色信號(hào)減少時(shí)，認(rèn)為基因表達(dá)下調(diào)或缺失，當(dāng)然要排除假陰性；而當(dāng)綠色信號(hào)不足2個(gè)時(shí)，則該細(xì)胞不納入計(jì)數(shù)范圍。這些發(fā)現(xiàn)提示：E-cadherin參與的EMT機(jī)制在胸腺瘤的侵襲過(guò)程中有著非常重要的作用。綜合分析，作者認(rèn)為E-cadherin參與胸腺瘤的侵襲進(jìn)程，其在有侵襲性和無(wú)侵襲性胸腺瘤的鑒別診斷中有一定的輔助意義。

β-catenin是由原癌基因編碼的一種細(xì)胞骨架蛋白，位于染色體3q21.3，全長(zhǎng)23.2 KB，含16個(gè)外顯子，其相對(duì)分子質(zhì)量為9.3×104。β-catenin是一種多功能蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞間的黏附和WNT信號(hào)的傳導(dǎo)。β-catenin可以與E-cadherin的胞內(nèi)區(qū)相互作用并參與E-cadherin黏附功能的調(diào)節(jié)，因此β-catenin發(fā)生故障會(huì)使E-cadherin參與細(xì)胞黏附失去穩(wěn)定性。此外，其還可以與E-cadherin胞內(nèi)區(qū)組成E-cadherin/cat復(fù)合體，這也是其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的前提條件。Wnt信號(hào)通路包括包膜卷曲蛋白、Wnt蛋白、E-cadherin、β-catenin、GSK-3p、Axin、APC、TCf以及松散蛋白等，β-catenin在此通路中有著重要的地位，其不但參與信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，還參與細(xì)胞間的黏附。此外，β-catenin還可激活EMT過(guò)程中的某些相關(guān)基因，如Fibronectin和Slug等，加速瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤的侵襲過(guò)程中均可見到β-catenin在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的異常蓄積[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)β-catenin蛋白和熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)β-catenin基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)β-catenin蛋白和基因在有侵襲性和無(wú)侵襲性胸腺瘤中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者認(rèn)為β-catenin對(duì)有侵襲性和無(wú)侵襲性胸腺瘤的鑒別診斷有一定的輔助意義。

綜上所述，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫組化法檢測(cè)E-cadherin和β-catenin蛋白及熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)E-cadherin和β-catenin基因，有助于無(wú)侵襲性和有侵襲性胸腺瘤的鑒別診斷。

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